Summary

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Published: August 10, 2018
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Summary

Hier bieten wir eine Methode zum Identifizieren und isolieren große Zahlen von GM-CSF myeloische Zellen unter Verwendung von high-Speed Zellsortierung angetrieben. Fünf verschiedene Populationen (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen, Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen, Monozyten, Monocyte abgeleitet Makrophagen und Monocyte abgeleitet DCs) können identifiziert werden, basierend auf Ly6C und CD115 Ausdruck.

Abstract

Kulturen der Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen (MoDC) generiert aus Maus Knochenmark mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) haben vor kurzem erkannt worden, heterogener als zuvor geschätzt werden. Diese Kulturen enthalten routinemäßig MoDC sowie Monocyte-abgeleiteten Makrophagen (MoMac) und sogar einige weniger entwickelten Zellen wie Monozyten. Das Ziel dieses Protokolls ist es, bieten eine einheitliche Methode zur Identifizierung und Trennung von den vielen Zelltypen in diesen Kulturen, wie sie sich entwickeln, so dass ihre spezifischen Funktionen weiter untersucht werden können. Die hier vorgestellten sortierungsstrategie trennt Zellen zuerst in vier Populationen basierend auf Ausdruck der Ly6C und CD115, die vorübergehend von Zellen exprimiert werden, wie sie in der GM-CSF-orientierte Kultur zu entwickeln. Diese vier Populationen gehören gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen CMP (Ly6C, CD115), Granulozyten/Makrophagen Stammväter oder GMP (Ly6C +, CD115), Monozyten (Ly6C +, CD115 +), und Monocyte-abgeleiteten Makrophagen oder MoMac (Ly6C, CD115 +). CD11c ist auch hinzugefügt, um die Sortierung Strategie, zwei Populationen innerhalb der Ly6C-CD115-Bevölkerung zu unterscheiden: CMP (CD11c-) und MoDC (CD11c +). Zu guter Letzt können zwei Populationen innerhalb der Ly6C-CD115 + Bevölkerung basierend auf der Ebene der MHC-Klasse II Ausdruck weiter unterschieden werden. MoMacs express untere Ebenen der MHC-Klasse II, während ein Monocyte abgeleitet-DC-Vorläufer (MoDP) höheren MHC Klasse II drückt. Diese Methode ermöglicht die sichere Trennung von mehreren Entwicklungsgeschichtlich verschiedene Populationen in Zahlen für eine Vielzahl von Funktions- und Entwicklungsstörungen Analysen ausreichend. Wir zeigen eine solche funktionelle auslesen, die differenzierten Antworten dieser Zelltypen auf Stimulation mit Pathogen-Associated molekulare Muster (PAMPs).

Introduction

Kultivierung der murinen Knochenmarkzellen mit dem Zytokin ist Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) als eine Methode verbreitet Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen (MoDC; auch bekannt als entzündliche DC) in großer Zahl 1zu generieren, 2,3,4,5. Diese Zellen sind sehr nützlich in einer Vielzahl von Studien von dendritischen Zellen (DC) Funktion 6,7,8gewesen. In der Regel diese murinen Knochenmarkzellen für 6-8 Tage kultiviert werden und dienen dann zur Studie von dendritischen Zellen Funktion 5. Diese Kulturen war lange vor allem homogen, bestehend aus einer Mehrheit von differenzierten MoDC betrachtet worden. Vor kurzem, ist deutlich geworden, dass am Ende dieser 6 – 8 Tage Kultur gibt es in der Tat viele MoDC, sowie einen großen Teil der differenzierten Monocyte abgeleiteten Makrophagen (MoMacs) 9,10,11. Unsere eigenen Studien haben diese Ergebnisse zeigen, dass andere Teilmengen von weniger entwickelten Zellen, wie MoDC Vorstufen (MoDP) und Monozyten, in den Kulturen bei niedriger Frequenz auch nach 7 Tagen 10 bleibenweiter ausgebaut. Somit konnten Studien von dendritischen Zellen (DC)-Funktion, die mit Zellen, die durch dieses System erzeugt die Antworten einer größeren Kohorte von Zelltypen reflektieren, als bisher angenommen.

Wir haben sehr viel gelernt aus der Studie von GM-CSF-generierte MoDC in Bezug auf die Funktion dieser Zellen in der Endphase der Differenzierung 12,13,14. Wir verstehen jedoch deutlich weniger über der Entwicklung weg von diesen Zellen 2,15,16 und des wie und wann sie spezifische weisen Funktionen wie: Reaktionsfähigkeit auf Pathogen Associated Molecular Muster (PAMPs), Phagozytose, Antigen Verarbeitung und Präsentation 13und antibakterielle Aktivität. Ein Protokoll für die Isolierung einer großen Zahl von konventionellen Flt3L angetrieben DC Stammväter und Vorläufer wurde gemeldeten 17. Isolierung von diesen unterschiedlichen Populationen wurde erreicht mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-)-gebeizt Knochenmarkzellen (um teilenden Zellen zu verfolgen) und Kultur in Flt3L für 3 Tage. Zellen wurden aus positiven Zellen erschöpft und in Vorläufer und Wegbereiter Populationen basierend auf CD11c Ausdruck 17sortiert. Ein anderer Ansatz von Leenen Gruppe, frühen Vorfahren der DC in der GM-CSF-orientierte Kultur zu identifizieren war, basierte auf CD31 und Ly6C 18Zellen Sortieren. Das ursprüngliche Ziel war die Schaffung eine ähnliche Methode für den Erhalt der Stammväter und Vorstufen von GM-CSF-orientierte MoDC. Aufgrund der spezifischen Zelltypen von GM-CSF generiert passten wir das Konzept und Sortierung Strategie basierend auf Ausdruck der Moleküle, die in frühen und späteren Phasen der Entwicklung zum Ausdruck gebracht wurden. Wir bestimmt letztlich, Ly6C, CD115 (CSF-1-Rezeptor), und CD11c wurden die besten Marker für diese Zelle Unterscheidung 10Typen.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von Zellen auf mehrere Phasen der Entwicklung den Weg der Differenzierung, angetrieben von GM-CSF: gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen (CMP), Granulozyten-Makrophagen Vorläuferzellen (GMP), Monocyte, Monocyte-abgeleiteten Makrophagen (MoMac) und DC (MoDC) Monocyte-abgeleitet. Die MoMac Bevölkerung kann weitere basierend auf Ebene der MHC-Klasse II Ausdruck getrennt werden enthüllt eine MoDC Vorläufer Bevölkerung (MoDP) 10. Wir nutzen eine High-Speed-Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Strategie um diese 5 Populationen anhand der Ausdruck Ly6C, CD115 und CD11c zu isolieren. Wir zeigen dann die Prüfung dieser Zellen im funktionellen Assays enthüllt ihre Reaktionen auf PAMP Stimulation.

Protocol

Alle tierische Arbeit wurde von der Auburn University institutionelle Animal Care und Nutzung hat in Übereinstimmung mit den Empfehlungen für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health in der Anleitung aufgeführten genehmigt. 1. Vorbereitung für Knochenmark-Sammlung Bereiten Sie 250 mL komplette Medien durch Zugabe einer Lösung von Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % fetalen Kälberserum, 2 mM Glutamin und 50 µM 2-Mer…

Representative Results

In dem Bemühen, so viele Kanäle wie möglich, lebensfähigen Zellen zur Analyse zur Verfügung zu halten wurden routinemäßig basierend auf vorderen und seitlichen streuen, ohne sehr klein und sehr granular Ereignisse (ein typisches Tor gilt für alles, was der Punkt in Abbildung 1AGrundstücke) ausgewählt. Um festzustellen, ob diese gating Strategie zuverlässig abgestorbene Zellen ausgeschlossen, gebeizt wir mit 7-Amino Actinomycin D (7-AAD) (<strong cl…

Discussion

Dieses Protokoll ermöglicht Isolation der GM-CSF-orientierte Vorläufer und Wegbereiter Zelltypen in Zahlen für verschiedene Arten von Analysen einschließlich der biochemischen Tests, Tests der Zellfunktion in Vitrooder Instillation in Vivoausreichend. Diese Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der Monocyte-abgeleitete Dendritische Zelle Entwicklung, ermöglichen die zuverlässige Isolierung und Identifizierung von Zellen in dieser Weg der Entwicklung als auch die differenziert…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind dankbar für die technische Unterstützung von Alison Kirche Vogel an Auburn Universität Schule von Veterinärmedizin Flow Cytometry Einrichtung, für Mittel aus der NIH EHS R15 R15 AI107773 und für die Zell- und Molekularbiologie-Programm an der Auburn University für Sommer Forschungsförderung, PBR.

Materials

RPMI 1640 Corning 15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS) HyClone SV30014.04 to supplement complete medium and FWB
GlutaMAX Gibco 35050 to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME) MP Biomedical 190242 to supplement complete medium
75mM Vacuum Filter Thermo Scientific 156-4045 to sterilize complete media
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E to lyse red blood cell
HEPES buffer Corning 21-020-CM to rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's Lonza 17-512F must be endotoxin free; chilled at 4 °C
35µm Cell filter Falcon 352235 to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSF Biosource PMC2011 usable concentration of 10ng/mL
Tissue cultured treated plate VWR 10062-896 for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4 Biolegend 128018
Anti-CD115, Clone AFS98 Tonbo Bioscience 20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3 BD Biosciences 557400 to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow Cytometer Beckman Coulter ML99030
BD Accuri C6 BD Biosciences 660517
100% Ethanol Pharmco-Aaper 111000200CSPP
60mm Petri Dish Corning, Inc 353002
50mL Conical tube VWR 21008-242
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratory 000664 Female; 10-20 weeks old
Biosafety Hood Thermo Scientific 8354-30-0011
10mL Syringe BD Biosciences 301604
23-gauge needle BD Biosciences 305145
Centrifuge 5810 R eppendorf 22625501
FlowJo Software v10 BD Biosciences Version 10 flowjo.com

Riferimenti

  1. Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
  2. Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
  3. van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
  4. Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  6. Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
  7. Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
  8. Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
  9. Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
  10. Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
  11. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
  12. Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
  13. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
  14. Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
  15. Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
  16. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  17. Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
  18. Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
  19. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
  20. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
  21. Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).

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Citazione di questo articolo
Rogers, P. B., Schwartz, E. H. Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy. J. Vis. Exp. (138), e57365, doi:10.3791/57365 (2018).

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