Construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida
Summary
Este protocolo describe un procedimiento detallado para la construcción de una biblioteca de fago que aparecen anticuerpos sintéticos con diversidad a medida. Anticuerpos sintéticos tienen amplias aplicaciones desde la investigación básica para diagnósticos de enfermedad y terapéutica.
Abstract
Demanda de anticuerpos monoclonales (mAbs) en investigación básica y medicina está aumentando cada año. Tecnología de hibridoma ha sido el método dominante para el desarrollo de mAb desde su primer informe en 1975. Como una tecnología alternativa, métodos de exhibición phage para mAb desarrollo son cada vez más atractivos puesto que Humira, el primer anticuerpo derivado de phage y uno de los superventas mAbs, fue aprobado para el tratamiento clínico de la artritis reumatoide en 2002. Como no animal basado en tecnología de desarrollo de mAb, exhibición phage omite la inmunogenicidad del antígeno, humanización y mantenimiento animal que se requiere del desarrollo de anticuerpos hibridomas tradicional basado en la tecnología. En este protocolo, se describe un método para la construcción de bibliotecas Fab fago muestra sintéticas con diversidades de9-10 1010 con una única electroporación. Este protocolo consta de: 1) preparación de células competentes electro alta eficiencia; 2) extracción de uracil-ADN monocatenario (ssDNA-dU); 3) el método de Kunkel basa mutagénesis dirigida por oligonucleótidos; 4) electroporación y cálculo del tamaño de la biblioteca; 5) enzima-ligado del inmunosorbente ensayo proteína basada en A/L (ELISA) para doblar y la evaluación de la diversidad funcional; y 6) análisis de la secuencia del ADN de la diversidad.
Introduction
mAbs tienen amplias aplicaciones que van desde la investigación básica a la terapia y el diagnóstico de la enfermedad. A partir de 2016, mAbs más de 60 han sido aprobados por la administración de la droga (FDA) y alimentos de Estados Unidos para el tratamiento clínico de enfermedades autoinmunes, cáncer y enfermedades infecciosas1,2.
En 1975 Kohler y Milstein reportaron una técnica para la generación continua de anticuerpos de una especificidad clonal solo de una fuente celular denominada “Hibridomas” y esta técnica se ha convertido posteriormente en un eje fundamental en la medicina y la industria3 ,4. Generación de mAbs por este método requiere varios pasos, incluyendo la producción de antígeno, ratón vacunación, extracción de los linfocitos B, fusión de las células B con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortal, selección de clones y para aplicaciones terapéuticas, humanización es necesaria para evitar el anticuerpo humano del anti-ratón (HAMA)4,5. Sin embargo, para esta tecnología, incluyendo toxinas, patógenos y proteínas altamente conservadas de los antígenos son relativamente ineficaces en accionar en vivo respuesta inmune para mAb producción5.
En 1978, Hutchison et al. divulgó el uso de un oligonucleótido a mutagénesis directa de un residuo en una sola hebra bacteriófago virus6. En 1985, Smith informó que fragmentos génicos extranjeros se pueden fusionar de marco con el gene que codifica la proteína de la cápsida del fago III y así pueden verse en la superficie de fagos sin comprometer su infectividad7. Estos pioneros trabajos sentaron las bases para la posterior construcción de las bibliotecas de fagos que aparecen anticuerpos en inmune, ingenuo, y forma sintética con los formatos de fragmento variable de cadena simple (scFv) y fragmento de antígeno-que ata (Fab) para terapéutica mAb desarrollo8,9. Desde el punto de vista técnico, desarrollo de anticuerpos basados en pantalla de fago ofrece un enfoque complementario al desarrollo mAb basados en hibridomas que puede ayudar a eludir las limitaciones de que algunos antígenos pueden presentar y la humanización del proceso los anticuerpos derivados de hibridoma a menudo requieren5. A partir de 2016, 6 mAbs de derivados de exhibición phage han sido aprobados en el mercado, incluyendo Humira, uno de los más exitosos mAbs utilizados para el tratamiento de la artritis reumatoide, y muchos candidatos de anticuerpos derivados de exhibición phage están en diversas etapas clínicas investigación10.
Para inmune ingenuo phage anticuerpo las bibliotecas y, la diversidad de determinantes de complementariedad (CDRs) de regiones de cadena ligera y pesada se deriva del repertorio inmune natural (es decir, de las células de B). Por el contrario, la diversidad de CDR ‘ s en las bibliotecas de anticuerpos sintéticos phage es totalmente artificial. Enfoques sintéticos para la construcción de la Biblioteca proporcionan un control preciso sobre el diseño de la diversidad de la secuencia y ofrecen oportunidades para el estudio de mecanismos de la estructura del anticuerpo y función11,12. Además, el marco para las bibliotecas sintético puede optimizarse antes de la construcción de la biblioteca para facilitar aguas abajo, el desarrollo industrial a gran escala11,12.
En 1985, Kunkel informó de un enfoque de mutagénesis basadas en plantillas de ADN (ssDNA) monocatenario introducir mutaciones sitio-dirigida en bacteriófago M13 eficientemente13. Este enfoque fue utilizado posteriormente para la construcción de bibliotecas de fagos que aparecen. Oligonucleótidos de DNA químicamente sintetizados diseñados para introducir diversidad en Fab CDRs se incorporan en un phagemid con una plantilla de columna vertebral del anticuerpo. En este proceso, la phagemid se expresa como una ssDNA que contiene uracilo (dU-ssDNA) y los oligonucleótidos son recocidos en la ECCD y extendidos para sintetizar ADN de doble cadena (dsDNA) en presencia de polimerasa de la DNA T7 y ligase de la DNA de T4. Finalmente, ds-DNA generado puede introducirse en Escherichia coli por la electroporación.
Para alta diversidad, construcción de biblioteca muestran en fago, electroporación de alta tensión de una mezcla de dos componentes de células electro-competentes y covalente dsDNA circular cerrada (CCC-dsDNA) debe ser preparado cuidadosamente. Sidhu et al modificar la preparación de células competentes de electro y el ADN de los métodos tradicionales y de diversidad de biblioteca mejorado en gran medida14.
En este protocolo, se describe un método para la construcción de bibliotecas Fab fago muestra sintéticas con diversidades de9-10 1010 con una única electroporación. La figura 1 muestra un resumen de la biblioteca construcción incluyendo: 1) preparación de células competentes electro alta eficiencia; 2) extracción de dU-ssDNA; 3) el método de Kunkel basa mutagénesis dirigida por oligonucleótidos; 4) electroporación y cálculo del tamaño de la biblioteca; 5) proteína A/L basado en ELISA para doblar y la evaluación de la diversidad funcional; y 6) análisis de la secuencia del ADN de la diversidad. Todos los reactivos, cepas y equipos se enumeran en la tabla de materiales. La tabla 1 muestra la configuración del reactivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para la construcción de alta diversidad, fago muestra Fab bibliotecas, control de calidad puntos de control son necesarios para monitorear distintas etapas del proceso de construcción, incluyendo la capacidad de células electro-competentes, calidad de la plantilla dU ssDNA, eficiencia de CCC-dsDNA síntesis, título después de la electroporación, plegable Fab y diversidad de aminoácidos de CDRs por análisis de la secuencia de los clones de fago Fab.
Alto rendimiento y pureza de dU-ssDNA…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecemos Dr. Frederic Fellouse del laboratorio de Sidhu para comentarios críticos en la construcción de biblioteca de Kunkel método basado sintético phage Fab. Los autores aprecian la Sra. Alevtina Pavlenco y otros miembros del laboratorio Sidhu ayuda valiosa de la preparación competente de electro de alta eficiencia de células de e. coli y de alta calidad dU-ssDNA. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant No.: 81572698, 31771006) a DW y por la Universidad de ShanghaiTech (Grant No.: F-0301-13-005) al laboratorio de ingeniería de anticuerpos.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
Riferimenti
- Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
- Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
- Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
- Hutchison, C. A., et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Sidhu, S. S. . Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , (2005).
- Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
- Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
- Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
- Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
- Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
- Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
- Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
- Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
- Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
- Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
- Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. . Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 157-180 (2006).
- Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).
- Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?. Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
- Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
- Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
- Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
- Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics – the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).
