Bau von synthetischen Phagen Fab Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt angezeigt
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für den Bau einer synthetischen Antikörper Phagen angezeigt-Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt. Synthetischen Antikörper haben breite Anwendungen von der Grundlagenforschung zur Krankheit Diagnostik und Therapie.
Abstract
Nachfrage für monoklonale Antikörper (MAK) in Grundlagenforschung und Medizin steigt jährlich. Hybridom-Technologie wurde die dominierende Methode für mAb Entwicklung seit seinen ersten Bericht im Jahr 1975. Als eine alternative Technologie sind Phagen-Display-Methoden für mAb Entwicklung zunehmend attraktiv, da Humira, der ersten Phagen abgeleitet Antikörper und eines der meistverkauften mAbs, für die klinische Behandlung der rheumatoiden Arthritis im Jahr 2002 genehmigt wurde. Als ein nicht-tierischen mAb Entwicklungstechnologie basiert, umgeht Phagen-Display Antigen Immunogenität, Humanisierung und tierischen Wartung, die von traditionellen Hybridom-Technologie basieren Antikörperentwicklung erforderlich sind. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Bau von synthetischen Phagen angezeigt Fab Bibliotheken mit Vielfalt von 109-1010 mit einem einzigen Elektroporation erhältlich. Dieses Protokoll besteht aus: 1) Hochleistungs-Elektro-kompetente Zellen Vorbereitung; (2) Extraktion von Uracil-haltigen einzelsträngiger DNA (dU-SsDNA); (3) Kunkels Methode basiert Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese; (4) Electroporation und Berechnung der bibliotheksgröße; (5) Protein A/L-based Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) zum Falten und funktionelle Diversität Bewertung; und 6) DNA-Sequenzanalyse der Vielfalt.
Introduction
mAbs haben breite Anwendungen von Grundlagenforschung bis hin zu Krankheit, Diagnostik und Therapie. Ab 2016 sind mehr als 60 mAbs durch die U.s. Food and Drug Administration (USFDA) für die klinische Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionskrankheiten1,2zugelassen.
Im Jahr 1975 berichtet, Kohler und Milstein, eine Technik für die kontinuierliche Erzeugung von Antikörpern eine einzelne klonalen Spezifität aus einer zellulären Quelle genannt “hybridome” und diese Technik später ein Eckstein in Medizin und Industrie3 geworden ist ,4. Generation von mAbs durch diese Methode erfordert verschiedene Schritte einschließlich Antigen Produktion, Maus Immunisierung, Gewinnung von B-Lymphozyten, Verschmelzung von B-Zellen mit Myelom-Zellen unsterblich Hybridoma Zellen, Klon-Auswahl, zu bilden und für therapeutische Anwendungen, Humanisierung ist erforderlich, um menschliche Anti-Maus-Antikörper (HAMA)4,5zu vermeiden. Für diese Technologie sind Antigene wie Toxine, Krankheitserreger und hoch konservierte Proteine jedoch relativ unwirksam bei der Auslösung einer Immunantwort in Vivo , mAb Produktion5.
Im Jahr 1978 berichtet Hutchison Et Al. die Verwendung von ein Oligonukleotid, direkte Mutagenese ein Rückstand in eine einsträngige Bakteriophagen Virus6. 1985 berichtete Smith, dass Fremd-gen-Fragmente können im Frame mit dem Gen Kodierung Phagen Hüllprotein III verschmolzen werden und somit auf der Phagen-Oberfläche angezeigt werden, können ohne seine Infektiosität7. Diese bahnbrechenden Werke einen Grundstein für den späteren Bau des Phagen angezeigt Antikörperbibliotheken in immun, naiv und synthetischen bildet mit den Formaten von Single-Chain Variable Fragment (ScFv) und Antigen-bindenen Fragment (Fab) für therapeutische mAb Development8,9. Aus technischer Sicht Phagen-Display-basierten Antikörper-Entwicklung bietet einen ergänzenden Ansatz für mAb Hybridom-basierte Entwicklung, die dazu beitragen kann, um die Beschränkungen zu umgehen, die einige Antigene darstellen können und die Humanisierung zu verarbeiten Hybridom abgeleitet Antikörper erfordern oft5. Ab 2016 6 Phage Display abgeleitet mAbs auf dem Markt, einschließlich Humira, eines der erfolgreichsten mAbs verwendet für die Behandlung der rheumatoiden Arthritis zugelassen und viele Phagen-Display abgeleitet Antikörper-Kandidaten befinden sich in verschiedenen Stadien der klinischen Untersuchung10.
Für immun- und naiv Phagen Antikörperbibliotheken, die Vielfalt der Komplementarität bestimmen Regionen (CDRs) in leichte und schwere Kette leitet sich aus dem natürlichen immun-Repertoire (d.h., von B-Zellen). Im Gegensatz dazu ist die Vielfalt der CDRs in synthetischen Phagen Antikörperbibliotheken völlig künstlich. Synthetische Ansätze zur Bibliotheksbau bieten präzise Kontrolle über das Design der Sequenz Vielfalt und bieten Möglichkeiten für mechanistische Studien der Antikörper-Struktur und Funktion11,12. Darüber hinaus kann der Rahmen für synthetische Bibliotheken vor Bibliotheksbau flussabwärts, groß angelegte industrielle Entwicklung11,12zu erleichtern optimiert werden.
1985, Kunkel berichtet einen einsträngige DNA (SsDNA) Template-basierte Mutagenese Ansatz effizient einzuführen Site-verwiesene Mutationen in Bakteriophage M1313. Dieser Ansatz wurde später für den Bau von Phagen angezeigt Bibliotheken verbreitet. Chemisch synthetisierten DNA Oligonucleotides entwickelt, um Vielfalt in Fab CDRs sind ein Phagemid mit einem Antikörper Rückgrat Template integriert. In diesem Prozess der Phagemid wird als ein Uracil-haltigen SsDNA (dU-SsDNA) ausgedrückt und die Oligonucleotides sind geglüht auf die CDRs und erweitert, um doppelsträngige DNA (DsDNA) im Beisein von T7 DNA Polymerase und T4 DNA-Ligase zu synthetisieren. Schließlich kann generierte ds-DNA durch Elektroporation in Escherichia coli eingebracht werden.
Für hohe Diversität, Phagen angezeigt Bibliotheksbau, Hochspannungs-Elektroporation von einer zwei-Komponenten-Mischung aus Electro-kompetente Zellen und kovalent sollten geschlossene kreisförmige DsDNA (CCC-DsDNA) sorgfältig vorbereitet werden. Sidhu Et Al. modifiziert die Vorbereitung von Electro-kompetente Zellen und DNA von traditionellen Methoden und stark verbesserte Bibliothek Vielfalt14.
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Bau von synthetischen Phagen angezeigt Fab Bibliotheken mit Vielfalt von 109-1010 mit einem einzigen Elektroporation erhältlich. Abbildung 1 zeigt eine Übersicht der Bibliothek Bau einschließlich: 1) Hochleistungs-Elektro-kompetente Zellen Vorbereitung; (2) Gewinnung von dU-SsDNA; (3) Kunkels Methode basiert Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese; (4) Electroporation und Berechnung der bibliotheksgröße; (5) Protein A/L-based ELISA zum Falten und funktionelle Diversität Bewertung; und 6) DNA-Sequenzanalyse der Vielfalt. Alle Reagenzien, Stämme und Ausrüstung sind in der Tabelle des Materialsaufgeführt. Tabelle 1 zeigt das Reagenz-Setup.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hohe Diversität, Phagen angezeigt Fab Bibliotheken, Qualitätskontrolle zu konstruieren sind Check-Points nötig, um verschiedene Phasen des Bauprozesses, einschließlich die Kompetenz der Elektro-kompetente Zellen, Qualität der Vorlage dU SsDNA, Effizienz der Überwachung CCC-DsDNA Synthese, Titer nach Elektroporation, Fab Falten und Aminosäure-Vielfalt der CDRs durch Sequenzanalyse der Fab-Phagen-Klone.
Hohe Ausbeute und Reinheit des dU-SsDNA ist wichtig für hohe Mutagenese Rate. Nach un…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren schätzen Dr. Frederic Fellouse aus dem Sidhu Labor für kritische Anmerkungen auf Kunkels beruhende Methode synthetische Fab Phagen Bibliotheksbau. Die Autoren schätzen Frau Alevtina Pavlenco und weiteren Mitgliedern aus dem Sidhu Labor für wertvolle Hilfe von Hochleistungs-Elektro-kompetente Vorbereitung E. Coli Zellen und hochwertige dU-SsDNA. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006), DW und der ShanghaiTech Universität (Grant No.: F-0301-13-005) Labor der Antikörper Technik.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
Riferimenti
- Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
- Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
- Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
- Hutchison, C. A., et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Sidhu, S. S. . Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , (2005).
- Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
- Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
- Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
- Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
- Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
- Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
- Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
- Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
- Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
- Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
- Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. . Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 157-180 (2006).
- Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).
- Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?. Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
- Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
- Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
- Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
- Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics – the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).
