Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias
Summary
Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.
Abstract
La capacidad de navegar hacia fuentes de olor de insectos se basa en la actividad de sus neuronas receptoras olfatorias de primer orden (ORNs). Mientras que se ha generado una cantidad considerable de información sobre respuestas ORN a los aceites, el papel de ORNs específicos en las respuestas del comportamiento de conducción sigue siendo mal entendido. Complicaciones en el análisis de comportamiento se presentan debido a diferentes volatilidades de odorantes que activan las ORNs individuales, múltiples ORNs activados solo olores, y la dificultad en reproducir naturalmente observadas variaciones temporales en estímulos olfativos utilizando métodos convencionales de olor-entrega en el laboratorio. Aquí, describimos un protocolo que analiza la conducta de larvas de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus ORNs. La tecnología optogenetic utilizada aquí permite la especificidad de la activación de la ORN y control preciso de los patrones temporales de la activación de la ORN. Correspondiente movimiento de larvas se realiza un seguimiento, grabados digitalmente y analizados usando custom software por escrito. Mediante la sustitución de estímulos de olor con estímulos de luz, este método permite un control más preciso de la activación individual de ORN para estudiar su impacto en el comportamiento larval. Nuestro método podría ampliarse aún más para estudiar el impacto de las neuronas de proyección de segundo orden (PNs) además de las neuronas locales (LNs) en comportamiento larval. Este método permitirá así a una disección completa de la función olfativa circuito y complemento de estudios sobre actividades de neurona olfativa cómo traducen en respuestas de comportamiento.
Introduction
Información olfativa en el entorno de una larva de Drosophila es detectada por solamente 21 ORNs funcionalmente diferentes, las actividades de las cuales en última instancia determinar comportamiento larval1,2,3,4. Sin embargo, relativamente poco se sabe acerca de la lógica por la que está codificada información sensorial en las actividades de estos 21 ORNs. Por lo tanto es necesario medir experimentalmente la contribución funcional de cada larva ORN a comportamiento.
Aunque el perfil de la respuesta sensorial del repertorio entero de ORNs larvas de Drosophila se ha estudiado en detalle1,4,5, las contribuciones de ORNs individuales al circuito olfatorio y de tal modo a comportamiento de navegación siguen siendo en gran parte desconocidos. En estudios de comportamiento larval, hasta el momento, dificultades debido a la incapacidad de espacial y temporal activar solo ORNs. Un panel de olores que se activan específicamente 19 de los 21 ORNs larvas de Drosophila fue descrito recientemente1. Cada olor en el panel, en bajas concentraciones, provoca una respuesta fisiológica de su cognado ORN. Sin embargo, en concentraciones más altas que se utilizan normalmente para los ensayos de comportamiento convencional, cada olor provoca respuestas fisiológicas de múltiples ORNs1,5,6. Además, los olores en este panel han variado volatilidades que complican la interpretación de los estudios de comportamiento que dependen de la formación de gradientes de olor estable7,8. Por último, naturalmente que ocurren estímulos de olor tienen un componente temporal que es difícil de reproducir en condiciones de laboratorio. Por lo tanto es importante desarrollar un método que puede medir el comportamiento larval mientras que simultáneamente activar ORNs individuales de una manera espacial y temporal.
Aquí, demostramos un método que tiene ventajas sobre el seguimiento de larvas previamente descrito ensayos1,8. El seguimiento se describe en Gershow et al. emplea válvulas controladas electrónicamente para mantener un gradiente estable de olor en la arena de comportamiento8. Sin embargo, debido a la compleja ingeniería para construir la configuración de estímulos de olor, este método es difícil de replicar en otros laboratorios. Además, siguen sin resolverse los problemas relacionados con el uso de aceites para activar específicamente solo ORNs. El seguimiento se describe en Mateo et al. emplea un sistema más simple de olor, pero el gradiente de olor resultante depende de la volatilidad de la prueba de olor y es inestable para las duraciones largas del ensayo1. Así, mediante la sustitución de estímulos de olor con estímulos de luz, nuestro método tiene las ventajas de especificidad y un control temporal de la activación ORN y no es dependiente en la formación de gradientes de olor de diferentes potencias.
Nuestro método es fácil de configurar y es apropiado para los investigadores interesados en la medición de aspectos de la navegación de larvas de Drosophila . Esta técnica podría adaptarse a otros sistemas de modelo siempre y cuando el investigador es capaz de conducir la expresión de CsChrimson en neuron(s) de su sistema favorito de la elección. CsChrimson es una versión rojo-cambiado de puesto de la rodopsina de la canal. Se activa en longitudes de onda que son invisibles al sistema de phototaxis de la larva. Por lo tanto somos capaces de manipular la actividad de las neuronas con especificidad, confiabilidad y reproducibilidad9. Modificando la costumbre escrita software para tener en cuenta para los cambios de tamaño de los sujetos, este método podría ser fácilmente adaptado para reptantes larvas de otras especies de insectos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un método que permite la medición de la conducta de larvas de Drosophila en respuesta a la activación de la optogenetic simultánea de neuronas olfativas. Descrito larvas seguimiento métodos1,8 utilizan la tecnología de entrega diferente olor para activar ORNs. Sin embargo, estos métodos no pueden controlar la especificidad o patrones temporales de la activación de la ORN. Nuestro método supera estos déficits mediante estímul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Nevada, Reno y por NIGMS del Instituto Nacional de salud bajo la concesión número GM103650 P20.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
Riferimenti
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