增强基因组编辑与 Cas9 Ribonucleoprotein 在不同的细胞和有机体

1. RNP 总成 提前做好实验设计, 提前获取所有的 RNA、DNA 和蛋白质成分。作为第一个通行证, 尝试在表1中列出的积极控制之一, 并使用材料表中描述的商业试剂, 以确保可靠的实验设计和材料的完整性。有关规划新的基因组编辑实验的其他提示, 请参阅本主题的论文12,42,43。注: 一旦按照后续步骤进行组装, 预先准备好的 RNPs 可以存储在-80 摄氏度。 选择目标的基因后, 使用一个免费的在线工具设计最佳 gRNA44,45,46,47,48。一定要瞄准一个外显子, 如果希望产生一个淘汰赛。注意: 这些工具将有助于识别具有相邻化脓PAM 序列、高质量评分和低目标得分的目标站点。 通过已发布的方法8纯化化脓Cas9 蛋白, 或从商业供应商购买它。 准备一个典型的 Cas9 缓冲, 为 RNA 稀释, RNP 准备和蛋白质储藏, 其中包含20毫米 HEPES pH 值 7.5, 150 毫米氯化钾, 10% 甘油和1毫米 TCEP。总是使用核酸酶的水在缓冲, 将用于并用重悬或稀释 RNA, 以防止退化。 通过使用已发布方法的体外转录生成导 RNA (tracrRNA 和 crRNA 或 sgRNA), 或从核酸合成公司 (17,21,49, ) 中购买它。50,51。 如果插入基因, 合成或购买捐赠者 DNA 模板。 储存蛋白质和 RNA 整除数在-80 摄氏度和解冻后立即在冰上使用。注: 每次冻融略有降低效率。Cas9 纯化52和体外转录 sgRNAs53的详细的开放访问协议在别处可用。 如果使用C. 线虫, 请跳到步骤1.5。对于hawaiensis协议, 请跳到步骤1.6。如果使用 sgRNA, 请跳到步骤1.4。继续步骤 1.3, 为主单元格编辑装配 gRNA。 通过混合摩尔数量的 tracrRNA 和 crRNA 来组装 gRNA。制作100µL 80 µM gRNA 股票, 约50个基因组编辑实验。 孵化的 gRNA 在37°c 30 分钟, 然后让它慢慢冷却到室温。 RNP 准备 HSPC 和 T 细胞编辑: 通过混合 1-2x 摩尔量 gRNA 到 pmol 蛋白质的总容积 10 Cas9, 组装一个 RNP 复合体. 非常缓慢, 添加集中µL Cas9 (预稀释在 gRNA 缓冲) 约三十年代, 用吸管快速绕圈, 使最终的 Cas9 浓度达到20µM。 准备电穿孔小试管。注意: 此协议特定于材料表中提到的商业系统, 但 RNP 编辑也可以与其他电穿孔设备一起完成。 添加5µL (100 pmols, T 细胞) 或10µL (200 pmol, HSPCs) RNP 到每个试管。 如果插入新的 DNA 而不是做一个挖空, 添加1µL 100 µM (100 pmol) 单链寡核苷酸捐献者 DNA (ssODN)25,54,55到小试管或水井的板块。 对于主单元格编辑协议中的下一个指令, 请跳到步骤 2 . RNP 准备C. 线虫编辑: 通过添加以下试剂来组装 RNP 复合体, 以创建最终体积为20µL (最后浓度在括号中指出): Cas9 (2 µM), HEPES pH 7.5 (10 µM), 氯化钾 (115 µM), crRNA (12 µM)、tracrRNA (40 µM) 和修复模板 (如果需要) (0.5 µM ssDNA 或最多 350 ng/µL dsDNA)。注: Cas9-mediated 的模板修复的效率与 dsDNA 修复结构的浓度成正比;因此, 修复模板的浓度越高, 模板修复的效率就越低。然而, 已证明注射含有大于350µL 的 dsDNA 的混合物可以降低注射蠕虫的生存能力。因此, 最好使用最多, 但不超过350µL 的 dsDNA 在混合, 以最大限度地提高维修效率, 同时尽量减少其杀伤力。 根据步骤5.4 中描述的共同 CRISPR/联合转换筛选方法, 在需要时添加多个 crRNAs 以同时针对多个定位点。添加多个 crRNA 时, 将每个顺序添加到主组合中。注: 每个 crRNA 的数量不需要相同, 甚至加倍 crRNAs 的总浓度, 而不改变 Cas9 的浓度, 似乎不会干扰在特定的部位突变的频率。示例在et中详细描述。56。 混合吹打和旋转的 RNP 溶液在 1.6万 x g 5 秒, 以确保解决方案收集在底部的管。 孵化溶液在37°c 为15米。 离心样品在 1.6万 x g 1 分钟, 以颗粒任何可能堵塞薄钻孔注射针的微粒。在后续步骤中使用上清。 跳到步骤 4, 以执行C. 线虫协议的其余部分。 RNP 准备P. hawaiensis编辑: 使用核酸酶水和苯酚红 (用于可视化注射) 稀释6.25 µM 和0.15% 苯酚红色的最后浓度, 制备单用途 Cas9 整除数。 通过将2-5x 摩尔过量的 gRNA 混合到 Cas9 蛋白质中, 组装 RNP 复合体, 总容积为6µl. 将 pmol 的 12 Cas9 添加到 gRNA, 使最终 Cas9 浓度达到2µM, gRNA 浓度为 4-8 µM, 苯酚红浓度为0.05%。 在室温下孵育混合物10分钟, 使 RNP 复杂。 跳到步骤 6, 以执行hawaiensis编辑协议中的下一个指令. 2. 细胞培养和制备 注意: 在生物安全柜中执行2.1.1 到3.3.3 的步骤。 从供应商处购买冻存的人工外周血 CD34+ HSPCs。 解冻 ~ 1 x106 HSPCs 在37°c 水浴为3分钟并且转移他们到15毫升圆锥管。添加10毫升的无血清膨胀培养基从商业来源和旋转的混合物在 100 x g 为10分钟. 移除上清和并用重悬在2毫升补充随机有限元的细胞。在 RNP 电穿孔前, 将细胞在6井板中, 并在37摄氏度孵化箱中培养成24-48 小时。 用 hemocytometer 计数单元格, 并将所需的 HSPCs 总数 (每试管 1.5亿 HSPCs 转) 转换为离心管。 旋转管在 100 x g 10 分钟, 以颗粒细胞。 从供应商处购买人类主 CD4+ T 单元格, 或者通过密度梯度离心29将它们从人的全血中分离出来。 在 T 细胞激活之前, 前涂层48井培养板材与αCD3 (UCHT1) 和αCD28 (CD28.2)。用500µL 10 µg/毫升αCD3 和10µg/毫升αCD28 在 PBS 上涂上板材, 至少2小时37摄氏度。注意: 对于某些位点, NHEJ 可以在没有预刺激的情况下实现, 但包括这一步将最大化其效率。 培养 T 细胞为48小时在37°c 在αCD3 或αCD28 抗体束缚的板在 RPMI 完全媒介 [RPMI-1640 补充与5毫米 HEPES, 2 毫米的商业替代 l-谷氨酰胺, 50 µg/毫升青霉素/链霉素, 50 µM 2 巯基乙醇, 5 毫米的非必需氨基酸, 丙酮酸钠的5毫米, 和 10% (卷/卷) 的血清]。在 200万 t 细胞的密度上培养 t 细胞在500µL 的媒介每井的48井板材。 用 hemocytometer 计数 t 细胞并将电穿孔实验所需的 t 细胞总数转移 (每试管100,000-1、000,000 T 细胞转) 到离心管。 旋转管在 90 x g 8 分钟, 以颗粒细胞。如果细胞密度梯度-在2天内分离, 旋转他们在 200 x g 为8分钟。 对于两种细胞类型, 用吸管/真空吸入上清液, 除去任何气泡。 每试管用20µL 的电穿孔缓冲器轻轻并用重悬细胞。 将20µL 的细胞 (1.5亿 HSPCs 或 100,000-1, 000,000 T 细胞) 添加到每个试管, 它已经包含了 RNP 的10µL, 并通过吹打上下混合而不产生气泡。 3. RNP 电穿孔 Electroporate 把小试管放在 nucleofector 后。对于 HSPCs, 使用脉冲编码 ER100。对于 T 细胞, 使用脉冲编码 EH-115。 仅 HSPCs:在电穿孔后立即向每个试管添加100µL 的补充随机有限元培养基 (加热到37°c), 并让细胞恢复 10-15分钟。 转移细胞培养他们在一个96井的圆底板和增加另外100µL 补充的随机有限元培养基为 24 h。 将它们改成新鲜的补充随机有限元培养基, 再孵化 24-72 小时。 取出细胞进行基因分型48-96 小时后电穿孔。旋转细胞在 300 x g 5 分钟, 并删除上清之前开始的 DNA 提取 (步骤 8.2)。 T 细胞只: 添加80µL 的 RPMI 完全培养基预热到37°c 从水库到每试管或好, 使用多通道吸管 (如果需要)。 孵化他们在37°c 15 分钟。 将适当的培养基、抗体、细胞因子、等添加到目标板上, 并在37摄氏度孵化器中预热。 使用多通道吸管 (如有必要) 将107µL 的转细胞从油井转移到圆底96井板。 有关评估编辑结果的信息, 请跳到步骤8。 4.线虫制剂 注射前1天: 为微注射准备琼脂糖垫。 在水中加入琼脂糖, 使溶液在热板或微波炉中煮沸, 以 3% (w/v) 琼脂糖溶液。 在桌子上排列24毫米 x 50 毫米 x 1.5 毫米的玻璃幻灯片, 并使用玻璃巴斯德吸管将一个小 (~ 15 µL) 滴琼脂糖溶液放到滑梯上。通过将另一盖玻片放在上面, 快速地拼合琼脂糖滴。允许琼脂糖固化, 然后删除其中一个盖玻片。 把琼脂糖涂层的盖玻片脸放在桌上过夜晾干。24小时后, 将琼脂糖垫存放在干净、干燥的容器中。注意: 这些可以无限期地使用。 拉注射针: 使用硅硅酸盐玻璃毛细血管与花丝 (外径1.0 毫米和内径0.58 毫米), 拉针基于梅洛和火57和其他资源58。针头可以立即使用, 也可以储存在一个干净的, 干燥的容器中, 由粘土支撑支撑。 为维护蠕虫, 准备一个线虫生长培养基 (NGM) 琼脂倒入培养板和发现与 OP50 细菌 (对于标准的C. 线虫维护和食谱的增长媒体, 请参见 Stiernagle59)。 对微注射的蠕虫进行12-24 小时的显微注射, 选择 L4-staged 雌雄同体到一个新的 NG 琼脂板上, OP50 细菌并在20摄氏度过夜。对于每个 Cas9 的目标/注射组合, 选择30蠕虫的盘子。 微注射日:使用步骤1.5 中准备的 RNP 溶液上清液加载拉入的微注射针. 将上清液吸管从步骤1.5.4 进入被拔出的毛细管吸管中, 将毛细管吸管中的溶液回填到所制备的微注射针头中 (通常加载少于0.1 µL)。 将载入的针装入附着在机器人上的微注射装置上。将注射器具压力设置为250帕, 平衡压力为25帕。 折断已加载的针尖, 产生锋利的针缘。放置一个15毫米 x 15 毫米 x 1.5 毫米正方形盖玻片在24毫米 x 50 毫米 x 1.5 毫米盖玻片的顶部。 覆盖正方形盖玻片的一边缘与卤化碳油700。 把针放在油中, 在15毫米盖玻片的边缘。 用手指导显微镜的舞台和盖玻片, 刷上和沿针的边缘, 同时压抑注射踏板/按钮。把针尖向后折断, 增加液体流出针的流量。通过使注射混合沿针边流动, 形成1气泡/s, 达到最佳流速。 证实 L4 蠕虫在注射前注射12-24 小时是发育阶段的年轻成年人。把幼虫带到一个缺乏 OP50 细菌的五琼脂盘子里, 让它们在5分钟内爬行。这可以减少转移到注射垫的细菌数量, 减少针头堵塞。 将琼脂糖注射垫/盖玻片放在解剖范围内。使用蠕虫采摘, 放置一个小轨道的卤化碳油沿一个边缘的垫。 利用在油中涂抹的蠕虫, 将几条蠕虫从五琼脂板上提起, 进入油的轨道。一个细的头发附着在吸管上, 如睫毛或猫晶须, 平行放置蠕虫, 轻轻地将蠕虫推入琼脂糖垫。在使用微注射的过程中, 一次只能装入一个蠕虫。注: 干琼脂糖将从蠕虫的水分, 使他们坚持到垫。因此, 你必须迅速工作, 因为蠕虫可以脱水。 一旦在位置和附加到垫, 覆盖蠕虫与另几滴卤化碳油 (~ 20 µL) 从顶端的蠕虫采摘。 5.线虫性腺注射 RNPs 和注射后护理 注: 微注射协议由梅洛和火57改编, 并在其他地方详细描述60,61。 将盖玻片与安装的蠕虫放到注射显微镜上。在低放大率 (5X 目标, 10X 眼), 定位蠕虫垂直于注射针。 切换到高放大倍数 (40X 目标, 10X 眼), 重新定位靠近性腺臂的针, 对应于中部至晚期粗线期的细胞核附近的区域。 使用机器人, 移动针对蠕虫, 轻微地压抑角质层。然后, 用一只手, 点击显微镜阶段的一侧, 通过角质层震动针。压低注射踏板/按钮, 慢慢填充性腺手臂与注射混合, 并删除针。 与另一只性腺手臂重复这一步。 一旦蠕虫被注射, 取出盖玻片/琼脂糖垫, 并将其置于解剖显微镜下。 使用被拉扯的毛细管吸管, 通过吹打一个 M9 缓冲在他们附近替换油从蠕虫。执行这种治疗, 以释放蠕虫从琼脂。 10分钟后, 当蠕虫在缓冲区中颠簸时, 用所拉毛细管吸管将它们移到 OP50 细菌的 NG 板上。把盘子放在20摄氏度, 2-3 小时, 直到蠕虫恢复并四处走动。 一旦恢复, 单独转移蠕虫到 NG 琼脂板块与 OP50 和转移板块到25°c 孵化器。 允许 P0注入的蠕虫生长并放置后代3天。筛选 F1子代。 如果使用 co CRISPR 或共转换62、63、64、65, 则根据它们是否具有参考基因的突变型, 选择候选蠕虫进行筛选。将这些标记的蠕虫单独转移到新的 OP50, 并允许它们在20摄氏度放置 F2子代。注: 用于联合 CRISPR 筛选或选择的表型应为 Cas9 编辑的成功提供早期估计。 如果 CRISPR 表型不存在, microinject 一个积极的控制质粒, 以协助提高注射效率。注: 例如, 包括注射混合中的质粒, 编码 mCherry 标记的 MYO-2 将有助于评估注射效率。成功注射 pCFJ90 的蠕虫将会有一些具有荧光 pharynxes 的后代。 检查 F1蠕虫是否存在所需的编辑。选择 F1母亲到一个96井板的个人井, 溶解她, 并检查她的 DNA, 无论是插入特异 PCR 放大, DNA 序列分析, 或测量师核酸酶化验 (CEL-1) 66.注意: 这些测试可以在使用 CRISPR/co 转换或其他筛选或选择机制65,66,67,68时执行。 有关评估编辑结果的信息, 请跳到步骤8。 6. hawaiensis准备 1天前的微注射, 丰富的早期胚胎通过建立一个 ‘ 一对坦克 ‘ 前一天晚上;新分离的雌性将含有新鲜受精的胚胎。请参见雷姆et 。69以了解详细信息。 在注射的当天, 用0.02% 丁香油在海水中收集单细胞的Parhyale胚胎 (0-4 小时后受精), 然后用火焰拉动的方法轻轻地刮掉她腹窝囊中的胚胎。圆形玻璃吸管和一双钝 #3 钳。 7. hawaiensis胚胎显微注射 RNPs 和注射后护理 回填一被拉扯的毛细管与大约1µL RNP 注射液混合物上面描述。 使用压缩氮气 microinject 每个胚胎, 如雷姆et . 中所述。69。 使用 microinjector 和机器人在解剖显微镜下注入Parhyale胚胎。使用 microloader 吸管尖, 将注射剂的1.5 µL 插入毛细管的背部 (4 inches-1.0 毫米和花丝, 用微拉动装置拉动)。 在注射装置上设置针头, 在解剖范围内用一对钳折断针 (非常小的数量) 的针尖。通过注入卤化碳油700和测量气泡直径来校准所交付的体积。 用剃刀刀片从固化剂中切下一个 “槽”。用过滤消毒的海水将其填入一半, 并将Parhyale胚胎排在槽中以稳定。 注射时, 用注射剂对胚胎进行注射, 用一对镊子稳定每个胚胎。注射后, 用玻璃转移吸管将胚胎转移到一个新鲜的60毫米培养皿中, 用过滤灭菌的海水在中途填充。 如果第一个分裂已经发生形成一个2细胞胚胎 (4-6 小时后受精), 通过注射两个卵裂球产生完全突变的动物。为确保2细胞阶段的完全分裂, 与 FITC 或 TRITC 葡聚糖共注入卵裂球, 观察在注射后荧光解剖范围内的信号仅限于单个卵裂球。 或者, 通过在2细胞阶段只注射两个卵裂球中的一个来生成 ‘ 半变种 ‘ 动物 (大致上根据 P 轴上的组织和位置来划分左右)。 在8细胞胚胎 (7.5-9 小时后受精) 中注入一个细胞, 以限制编辑到单一的胚芽层。请参见 Gerberding et 。70用于早期卵裂球血统的地图。 在60毫米培养皿中孵化胚胎 (不超过25每道菜), 用过滤消毒的海水半填充, “预氧化” 使用水族馆涌泉或剧烈摇晃。 将胚胎的盘子放在一个松散密封的 plasticware 内, 用湿纸巾衬里, 以保持湿度, 并将它们放在一个26摄氏度的恒温箱中, 12 小时的光暗循环。 每隔几天把幸存的胚胎转移到清洁海水的盘子里。注意: 胚胎可以在室温下培养, 尽管它们的发育速度会慢得多。 通过原位杂交或抗体染色, 解剖和修复不同阶段的胚胎, 以进行表达分析 (见布朗et 。71用于暂存指南, 以及用于解剖和固定的其他引用72、原位杂交73和抗体染色74)。 通过将一根弯曲的钨丝长度大约0.5 到胰岛素针的末端进行解剖针。在电流下将氢氧化钠中的针削尖。使用1毫升注射器作为解剖针的手柄。 在一半的3井玻璃盘子中, 用一个新的解决方案9部件 PEM 缓冲器 (0.1 米的管道 pH 值 6.95, 2 毫米的 EGTA, 1 毫米的 MgSO4), 1-部分 10x PBS, 1 部分32% 粉煤灰。将3-5 个胚胎放入盘子中, 然后将一个小孔戳进每个胚胎, 用一根锋利的钨针戳一下, 稍微迟钝一点, 以稳定, 允许蛋黄流出, 固定器跑进去。 使用一对削尖的钨针, 轻轻地将周围的两个膜包围在Parhyale胚上。解剖它们在固定, 使胚胎更健壮, 但迅速工作, 以保持膜不变的胚胎, 这使得膜去除更加困难。允许胚胎修复15-20 分钟的抗体染色或40-50 分钟的原位杂交。 图像活孵化和分析他们的形态学和行为表型或修复和染色, 以更详细的分析。在2-3 月内提高幼仔的性成熟度, 建立淘汰赛和转基因线 (见 Kontarakis 和 Pavlopoulos75幼体护理和其他有用的细节)。 8. 评估编辑结果 如果适用, 在编辑过的细胞或生物体中寻找视觉或功能表型。注意: 此过程将因应用程序而异, 在上面的相关协议步骤结束时将介绍一些示例。在纠正 HSPCs 镰状细胞突变后, 用 HPLC 法分析不同孵育的血红蛋白产生情况 (图 1A)。IL-2 受体基因在 T 细胞中的挖空可以通过表面染色和流式细胞术 (图 1B) 来确定。要评估线虫和hawaiensis表型, 请观察在光或荧光显微镜下的动物形态学和行为 (图 1C和1D)。 为了确定生成的基因组编辑的效率和类型, 溶解编辑过的细胞池并使用商业提取套件21提取其基因组 DNA。 为快速估计 indel 形成, PCR-放大至少200基对在切口站点附近并且执行 T7 endonuclease1 (T7E1)76或测量师 (CEL-1 核酸酶) 化验 77. 如果 Cas9-cut 站点上的 indel 组或成功的 HDR 将创建或删除已知的限制站点, 请考虑使用限制酶消化来估计编辑效率6。限制片段长度多态性 (限制性) 法可以作为一种方便的方法来检查效率, 如果它碰巧是可用的。 为准确量化编辑效率和主要编辑结果的确定, 发送 PCR 扩增子的标准的桑格测序与正反引物。注意: 如果分析单个克隆或有机体, 则对桑格结果的分析很简单, 如图 2a所示。如果分析单元格池, 则使用联机工具78分析图谱, 如图 2B所示。 要进行完整的量化和编辑结果序列, 请执行深度排序27、54, 如图 2C中所示。 为了评估一组特定的非目标变化, PCR-放大预测的非目标站点, 并将它们发送给。要启用对染色体易位的检测, 请执行引导序列79或高通量、全基因组移位顺序 (HTGTS)80。有关克隆填充中的非目标编辑的完整图片, 请执行全基因组排序 (WGS)81,82,83。注意: 有多种方法来量化对和非目标基因组的编辑, 在各种评论文章中进一步解释了84,85,86。