Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

La barrière hémato – encéphalique est une interface étroitement contrôlée entre le sang et le cerveau qui détermine ce qui se passe dans et sort du cerveau. Anatomiquement, cellules endothéliales composent la barrière hémato – encéphalique et forment un réseau capillaire complexe et continu. Physiologiquement, ce réseau capillaire alimente le cerveau en oxygène et en nutriments tout en simultanément élimination du dioxyde de carbone et les déchets métaboliques. Ce qui est important, la preuve étaye que les modifications apportées à la barrière contribuent à nombreuses pathologies comme la maladie d’Alzheimer, l’épilepsie et AVC^{1,2,3,4,5 , 6 , 7}. cerveau cellules endothéliales servent également un obstacle au traitement en bloquant l’absorption de drogues dans le cerveau, par exemple., chimiothérapie du glioblastome multiforme suite tumeur résection^{8,9, 10}. À cet égard, les capillaires du cerveau humain isolé représentent un modèle de barrière hémato – encéphalique unique ex vivo qui ressemble étroitement à barrière propriétés in vivo, qui permet l’étude de la fonction de barrière et de dysfonctionnement en santé et la maladie. Dans cet article, nous fournissons un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du cerveau humain à une qualité constante capillaire et le rendement afin d’étudier la barrière hémato – encéphalique.

En 1969, Siakotos et al. ¹¹ ont été le premier à signaler l’isolement des capillaires de cerveau du tissu de cerveau bovines et humaines utilisant la densité gradient centrifugation et verre perle colonne séparation. Plus tard, Goldstein et al. ¹² ce procédé amélioré en ajoutant plusieurs étapes de filtration pour diminuer la quantité de tissu nécessaire pour étudier les capillaires de cerveau isolées de rats, tout en maintenant l’activité métabolique du transport du glucose. Depuis lors, les chercheurs optimisé la technique d’isolation capillaire maintes fois, amélioration du procédé et cerveau modèle capillaire avec chaque itération^13,14,15. Par exemple, airelles et al. ¹⁶ isolé bovines capillaires à l’aide de la digestion enzymatique et non homogénéisation mécanique et puis par la suite passé une suspension capillaire à travers un filtre à tamis 210 µm et une colonne de perle de verre. Ces modifications amélioré la tache d’exclusion bleu trypan des capillaires cérébraux isolés et ainsi, augmenter la viabilité des cellules endothéliales. Dans les années 1990, Dallaire et al. ¹⁷ isolées des bovins et rat des capillaires qui étaient claires de contamination neuronale et maintient l’activité métabolique des γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase) et la phosphatase alcaline. En 2000, Miller et al. ¹⁸, utilisé isolé du rat et des capillaires de cerveau porcin en combinaison avec la microscopie confocale à montrer l’accumulation des substrats de transport dans la lumière des capillaires. Par la suite, notre laboratoire a continué d’optimiser la procédure d’isolement capillaire de cerveau et nous avons établi des essais de transport afin de déterminer la P-glycoprotéine (P-gp)^19,20,21, le cancer du sein résistance à la protéine (BCRP)^22,23et multirésistance protéine 2 (Mrp2) activité de transport de²⁴ . En 2004, nous avons publié deux rapports où nous avons utilisé des capillaires de cerveau de rat isolé pour enquêter sur les différentes voies de signalisation. Hartz et al. ²¹, nous avons trouvé que le peptide de l’endothéline-1 rapidement et de façon réversible réduit fonction transport P-gp dans les capillaires de cerveau en agissant par l’intermédiaire du récepteur de l’endothéline récepteur B (ET_B), l’oxyde nitrique synthase (NOS) et protéine kinase C (PKC). Dans Bauer et al. ¹⁹, nous avons démontré l’expression du récepteur récepteur nucléaire pregnane X (PXR) et montre PXR-modulation de la P-gp expression et transport fonction dans les capillaires du cerveau. Dans des expériences avec des souris transgéniques de PXR humanisés, nous avons élargi cette ligne de recherche et montré in vivo de serrage de la barrière de ses P-gp et hPXR activation²⁵. En 2010, Hartz et al. ²⁶ a utilisé cette méthode pour restaurer l’expression des protéines P-gp et transporter l’activité chez les souris de protéine (hAPP) précurseur de l’amyloïde humain transgénique qui surexpriment hAPP. En outre, rétablir la P-gp dans hAPP souris réduit significativement la bêta-amyloïde (Aß)₄₀et taux bêta-amyloïdes dans le cerveau₄₂.

En plus d’étudier les voies de signalisation, les capillaires cérébraux isolés peuvent être utilisés pour déterminer les changements dans la perméabilité capillaire que nous appelons une fuite capillaire. En particulier, le test de fuite de Texas Red est utilisé pour évaluer la fuite du colorant fluorescent Texas rouge de la lumière capillaire dans le temps et ces données sont ensuite utilisées pour analyser le taux de fuite. Les taux de fuite capillaire accrue par rapport à celles des capillaires de contrôle indiquent des changements dans l’intégrité physique de la barrière hémato – encéphalique². C’est précieux parce qu’il y a de nombreux états pathologiques liés à la rupture de la barrière, par exemple., épilepsie, sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer et traumatisme cérébral lésion^{27,28,29, 30}. Autres groupes ont également utilisé des capillaires isolées pour discerner les voies de signalisation qui régulent l’expression de la protéine et l’activité de transport des protéines^{31,32,33,34, 35,36,37}. Enfin, nous avons continué à optimiser cette méthode pour l’isolement des capillaires du cerveau humain et, récemment, nous avons montré expression accrue de la P-gp à l’humaine barrière hémato – encéphalique chez les patients atteints d’épilepsie par rapport aux individus de témoin sans saisie³⁸ . Pris ensemble, ces développements démontrent que les capillaires cérébraux isolés peuvent servir d’un modèle polyvalent pour étudier la fonction de barrière.

Divers in vivo, ex vivoet in vitro de barrière hémato – encéphalique modèles ont été utilisés en recherche fondamentale et de dépistage des drogues industrielle, principalement dans le but de tester des medicaments pour le cerveau^39,,^{40,41 ,42,43,44}. Outre isolés ex vivo le capillaires du cerveau, les modèles actuels de barrière hémato – encéphalique comprennent des modèles de in silico , in vitro culture cellulaire des cellules endothéliales des capillaires cérébraux isolés ou de lignées cellulaires immortalisées par divers espèces, la culture in vitro des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) qui se différencient en cellules endothéliales capillaires du cerveau et des modèles sur une puce microfluidique.

In silico modèles sont plus couramment utilisés dans le développement de médicaments pour la sélection des candidats-médicaments basés sur prédite d’absorption, distribution, métabolisme et excrétion (ADME) Propriétés. Méthodes telles que les modèles de relation (QSPR) quantitative structure-propriété et quantitative structure-activité (RQSA) sont des méthodes populaires utilisés dans le criblage à haut débit des bibliothèques pour prédire la pénétration de cerveau de candidats-médicaments ^{45 , 46}. ces modèles sont utiles aux molécules d’écran des propriétés de barrière de la pénétration.

Betz et al. ⁴⁷ a créé monocouches de cellules endothéliales des capillaires cerveau cultivé comme un système de modèle in vitro barrière hémato – encéphalique. In vitro cell cultures de modèles à l’aide de tissu frais ou lignées de cellules endothéliales immortalisées comme les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébrale humaine (hCMECs) peuvent être un autre outil de criblage à haut débit pour la pénétration du cerveau ou des études mécanistes. Cependant, les modèles de culture de cellules endothéliales capillaires cerveau n’ont pas la contrainte de cisaillement physiologique du débit sanguin à l’intérieur de la lumière capillaire, sont limitées à une complexité biologique dans l’ensemble et subissent des changements dans l’expression et la localisation des composants de la barrière importante comme les protéines des jonctions serrées, ion, les transporteurs, les enzymes et les récepteurs de surface de canaux^48,49,50. À l’inverse, monocouches endothéliales dérivé de hPSCs, présenter une perméabilité de saccharose faible par rapport aux cultures hCMEC/D3 et contenir l’expression polarisée de certains transporteurs de barrière hémato – encéphalique, molécules d’adhérence et de jonctions serrées^{51, 52}. Cependant, ces cellules sont également sous réserve de modification des propriétés dans la culture et le système doit être validé pour sa récapitulation de in vivo de propriétés de barrière⁵².

Nouvelles tendances dans la recherche de la barrière hémato – encéphalique incluent utilisant des systèmes de culture de tissu 3D pour créer artificielles capillaires, utilisant la technologie de l’orgue-on-chip pour générer des dispositifs microfluidiques, ou utilisant les fibres creuses technologie^{53, 54 , 55}. les capillaires artificiels, cependant, ont significativement plus grands diamètres (100 – 200 µm) que des capillaires de cerveau (3 – 7 µm). Par conséquent, les forces de cisaillement l’in vitro ne ressemblent pas entièrement à la situation in vivo . Ceci est abordé dans la microfluidique « blood-brain-barrier-on-a-chip », où les membranes artificielles forme « sang » et le « cerveau » compartiments et fluides sont pompés grâce à ces dispositifs de génération de forces de cisaillement microfluidique. De même, des cultures de cellules endothéliales dans différentes combinaisons avec les astrocytes et les cellules musculaires lisses vasculaires ont également été utilisés avec la technologie de fibres creuses pour recréer les paramètres rhéologiques présents sous in vivo des conditions^{56 , 57 , 58}. Toutefois, on ignore comment ce modèle reflète les autres propriétés de la barrière hémato – encéphalique, tels que le transport, le métabolisme, de signalisation et d’autres. Ces modèles capillaire et puce artificiels ne conviennent pas pour le criblage à haut débit des médicaments, mais les cellules utilisées pour générer ces modèles sont également sujettes à modification durant la culture.

Tranches de cerveau gelé et fixe ou cerveau primitif des cultures de cellules endothéliales capillaires sont des modèles supplémentaires qui peuvent être utilisé pourétudier la microcirculation humaine^5,59,60,61. Par exemple, immunohistochimie des tissus cérébraux fixe est utilisée pour déterminer la localisation des protéines et expression en bonne santé par rapport aux tissus malades.

En plus de modèles in vitro et de tranches de tissus capillaires du cerveau décrit ci-dessus, fraîchement isolées peuvent être utilisés pour étudier la fonction de barrière hémato – encéphalique. Limites de ce modèle capillaire isolé comprennent la difficulté pour obtenir des tissus du cerveau humain frais, absence d’astrocytes et les neurones et un processus relativement long isolement. Un avantage du modèle capillaires cérébraux isolés est que ce modèle ressemble beaucoup à la situation in vivo et, par conséquent, peut être utilisé pour caractériser la dysfonction et la fonction de barrière. Ce qui est important, il peut être également utilisé de discerner les mécanismes de signalisation à l’aide d’une multitude de tests et techniques moléculaires^3,19,62,63.

Notre laboratoire a accès à ces deux tissus de cerveau humain frais et surgelés à travers le centre de Sanders-Brown sur le vieillissement (CISR #B15-2602-M)⁶⁴. Dans ce contexte, les autopsies suivent un protocole standard, les cerveaux est obtenus en < 4 h et toutes les procédures sont conformes aux NIH recueillis de pratiques recommandées,⁶⁵. Compte tenu de cet accès unique aux tissus du cerveau humain, nous avons établi et optimisé un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain qui se traduit par un rendement élevé des capillaires de cerveau humain intact et viables. Deux points de terminaison communes d’intérêt sont à déterminer l’expression de la protéine et l’activité. À cet égard, nous et autres avons établi divers tests qui peuvent être utilisés avec les capillaires cérébraux isolés pour étudier l’expression des protéines et des niveaux d’activité. Ces essais incluent Éponger occidental, dosage Simple Western, immuno enzymatique (ELISA), chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR), PCR quantitative (qPCR), zymographie, tests d’activité de transport, et essais de fuite capillaire. Ces tests permettent aux chercheurs d’étudier des changements en fonction de la barrière dans des conditions pathologiques humaines, déterminer les voies qui régissent l’activité et l’expression de la protéine et identifier les cibles pharmacologiques pour le traitement de la barrière hémato – encéphalique associé maladies.

Prises ensemble, fraîchement capillaires cérébraux isolés peuvent servir de modèle robuste et reproductible de la barrière hémato – encéphalique. Surtout, ce modèle peut être associé à plusieurs différents dosages pour déterminer un large éventail de points de terminaison pour étudier la fonction de barrière.