Utilizzando Terminal transferasi-mediata dUTP Nick End-labelling (TUNEL) e caspasi 3/7 saggi alla morte delle cellule epidermiche di misura in rane con Chytridiomycosis
Summary
Quantifichiamo la morte delle cellule epidermiche in rane con chytridiomycosis utilizzando due metodi. In primo luogo, utilizziamo terminal transferasi-mediata dUTP nick end-labelling (TUNEL) in situ istologia per determinare le differenze tra animali clinicamente infetti e non infetti. In secondo luogo, conduciamo un’analisi di serie temporali di apoptosi sopra infezione utilizzando un’analisi della proteina di caspase 3/7.
Abstract
Gli anfibi stanno vivendo una grande perdita di biodiversità a livello mondiale e una delle cause principali è la malattia infettiva chytridiomycosis. Questa malattia è causata dall’agente patogeno fungoso Batrachochytrium chytrid (Bd), che infetta e sconvolge epidermide rana; Tuttavia, le mutazioni patologiche non sono state caratterizzate in modo esplicito. Apoptosi (morte programmata delle cellule) possono essere utilizzato dagli agenti patogeni per danneggiare il tessuto ospite, ma possono anche essere un meccanismo di host di resistenza alle malattie per la rimozione dell’agente patogeno. In questo studio, quantifichiamo la morte delle cellule epidermiche di animali infetti e non infetti, utilizzando due diversi dosaggi: terminal transferasi-mediata dUTP nick end-labelling (TUNEL) e caspase 3/7. Utilizzando ventrale, dorsale e il tessuto della pelle della coscia nell’analisi di TUNEL, osserviamo delle cellule morte le cellule epidermiche di in situ di animali clinicamente infetti e confrontare la morte delle cellule con animali non infetti utilizzando la microscopia a fluorescenza. Al fine di determinare come livelli di apoptosi nell’epidermide cambiano nel corso dell’infezione abbiamo rimuovere campioni punta ogni due settimane per un periodo di 8 settimane e utilizzare un’analisi di caspase 3/7 con proteine estratte per quantificare l’attività all’interno dei campioni. Abbiamo quindi correlare l’attività della caspasi 3/7 con carico di infezione. L’analisi di TUNEL è utile per la localizzazione delle cellule morte in situ, ma è costoso e tempo intensivo per campione. L’analisi di caspase 3/7 è efficiente per campioni di grandi dimensioni e tempo esperimenti del corso. Tuttavia, perché Rana punta punta le biopsie sono piccole c’è estratto limitato disponibile per la standardizzazione di esempio tramite metodi di quantificazione della proteina, ad esempio, il saggio di Bradford. Pertanto, vi consigliamo di stimare la superficie della pelle attraverso analisi fotografica delle biopsie di punta per evitare di consumare gli estratti durante la normalizzazione del campione.
Introduction
Gli anfibi uno stanno vivendo le più grandi perdite di biodiversità globale di qualsiasi vertebrato taxa1. Delle principali cause di questi declini è il chytridiomycosis malattia mortale della pelle, causata dall’agente patogeno fungoso Batrachochytrium chytrid, Bd2. L’agente patogeno infetta superficialmente l’epidermide, che può causare la rottura della funzione della pelle con conseguente perdita dell’elettrolito grave, arresto cardiaco e morte3. Vari meccanismi immuni potenziale ospite contro Bd sono attualmente allo studio, quali peptidi antimicrobici4,5, flora batterica cutanea6, delle cellule immuni recettori7,8, e del linfocita attività9,10. Tuttavia, pochi studi esplorare se epidermica morte delle cellule e l’apoptosi è un meccanismo immune contro questo agente patogeno mortale.
Morte cellulare, sia attraverso l’apoptosi (morte programmata delle cellule) o necrosi (morte non programmata), nell’epidermide può essere una patologia dell’infezione di Bd . La ricerca precedente suggerisce che l’infezione Bd può indurre apoptosi perché la rottura delle giunzioni intracellulari è osservata quando pelle espianti sono esposti a zoospore surnatanti in vitro11. Inoltre, i cambiamenti degeneranti epidermici in Bd-rane infetti sono osservate usando microscopia elettronica12,13. Analisi trascrittomica indicano che le vie di apoptosi sono sovraregolati in pelle infetta14e anfibio splenocytes apoptosi quando sono esposti a Bd surnatanti in vitro15. Nonostante il volume crescente di prove che suggeriscono che il Bd può indurre apoptosi e host delle cellule morte in vitro, in vivo studi che Esplora o misurare il apoptosis meccanismi attraverso la progressione dell’infezione sono carenti. Inoltre, non è noto se l’host utilizza apoptosi come una strategia difensiva sistema immunitaria per combattere infezione Bd , o se l’apoptosi è una patologia della malattia.
In questo studio, abbiamo mirato a rilevare la morte delle cellule epidermiche e apoptosi in animali infettati in vivo utilizzando due metodi: l’analisi della proteina di caspase 3/7 e terminal transferasi-mediata dUTP nick in situ il saggio fine-etichettatura (TUNEL). Come ogni dosaggio rileva diversi aspetti di cellule morte16, insieme questi metodi forniscono una piena comprensione dei meccanismi coinvolti nella morte delle cellule e garantiscono una misura accurata dell’effetto. L’analisi di caspase 3/7 quantifica l’attività delle caspasi effettrici 3 e 7, che consente la quantificazione di entrambe le vie intrinseca ed estrinseca apoptosi. Al contrario, l’analisi di TUNEL rileva la frammentazione del DNA, che è causata da meccanismi di morte cellulare tra cui apoptosi, necrosi e pyroptosis17. Utilizziamo l’analisi di TUNEL per indagare la posizione della morte delle cellule all’interno dell’epidermide degli animali sia clinicamente infetti e non infetti usando le tre sezioni differenti della pelle: dorsum, il venter e la coscia di Pseudophryne corroboree. Questo metodo identifica il sito anatomico di morte delle cellule, nonché a distinguere la sua posizione all’interno di specifici strati epidermici. Usiamo quindi l’analisi di caspase 3/7 per condurre una quantificazione di serie tempo di apoptosi nel corso di un’infezione di 8 settimane in Litoria verreauxii alpina. Prendiamo la punta punta campioni ogni due settimane dagli stessi animali e sono in grado di correlare patogeno infezione carico con l’attività della caspasi 3/7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo esplorato epidermica apoptosi e morte cellulare come un potenziale meccanismo di patologia del chytridiomycosis malattia mortale o un meccanismo di resistenza alle malattie in specie sensibili Bd . Abbiamo usato due metodi di valutazione della morte delle cellule nell’epidermide, analisi di TUNEL per analisi di morte in situ delle cellule epidermiche e l’analisi di caspase 3/7 per il monitoraggio di morte delle cellule epidermiche in tutto lo stato di avanzamento dell’infezione. Abbiamo trovato …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringraziano le seguenti persone che ci ha assistito con allevamento e raccolta di dati: Tegtmeier D., C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, Harney N. e T. Knavel; e M. Merces per assistenza con le dissezioni. Vorremmo anche ringraziare M. McFadden, P. Harlow e Taronga Zoo per la raccolta di L. v. alpinae G. Marantelli per sollevare il p. corroboree. Si ringrazia F. Pasmans, r. Martel per consigli su saggi di apoptosi, C. Costantino, r. Kladnik e R. Webb per assistenza con analisi di TUNEL, e Salvatore T. e W. Weßels per aiutare con protocollo e kit per l’analisi di caspase 3/7. Questo manoscritto e protocollo è adattato da Brannelly et al 2017 Peer J22.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
Riferimenti
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
- Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
- Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
- Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
- Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
- Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
- Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
- Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
- Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
- Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
- Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
- Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
- Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
- Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
- Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
- Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
- Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).
