Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme
Summary
Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.
Abstract
Bioelectricity, endojen elektrik iyon kanalları tarafından aracılı sinyalleşme ve hücre zarı üzerinde bulunan pompalar oynar gibi telaşlı nöronal ve kas hücrelerinin süreçleri ve birçok diğer biyolojik süreçler, sinyal önemli roller embriyonik gelişimsel desenlendirme. Ancak, in vivo omurgalı embriyogenez elektrik etkinliğini izleme için bir ihtiyaç vardır. Genetik olarak kodlanmış floresan voltaj göstergelerinin (GEVIs) gelişmeler bu sorun için bir çözüm sağlamak mümkün kılmıştır. Burada, nasıl bir transgenik voltaj göstergesi Zebra balığı kurulan voltaj göstergesi, ASAP1 kullanarak oluşturulacağını açıklar (hız sensörü, Aksiyon potansiyelleri 1), örnek olarak. Tol2 kit ve her yerde birden bulunan Zebra balığı organizatörü, ubi, bu çalışmada seçildi. Biz aynı zamanda ağ geçidi siteye özgü klonlama, Tol2 transposon tabanlı Zebra balığı transgenesis ve normal epifluorescent mikroskoplar kullanarak aşamasındaki balık embriyo ve balık tümörleri için görüntüleme işlemi işlemleri açıklar. Bu balık satırını kullanarak, Zebra balığı embriyo ve balık larva hareketi sırasında hücresel elektrik voltaj değişiklikleri vardır bulundu. Ayrıca, birkaç Zebra balığı Malign periferik sinir kılıf tümörleri içinde çevresindeki normal dokuların hücreleri genellikle polarize tümör karşılaştırıldığında gözlendi.
Introduction
Bioelectricity endojen elektrik iyon kanalları ve hücre zarının1üzerinde bulunan pompalar aracılı sinyalleşme için ifade eder. Hücresel membran ve eşleşmiş Elektrik potansiyeli ve geçerli değişiklikleri, iyonik değişim süreçleri telaşlı nöronal ve kas hücrelerinin sinyal için gereklidir. Buna ek olarak, bioelectricity ve iyon degradeler çeşitli enerji depolama, biyosentezi ve metaboliti ulaşım da dahil olmak üzere diğer önemli Biyolojik işlevleri var. Biyoelektrik sinyal Ayrıca embriyonik Desen oluşumu, vücut eksenleri, hücre döngüsü ve hücre farklılaşması1gibi bir düzenleyici olarak keşfedilmiştir. Böylece, bu tür sinyal yanlış düzenlenmesi neden pek çok insan Konjenital hastalıklar anlamak için önemlidir. Yama kelepçe yaygın tek hücreleri kaydetmek için kullanılmıştır, aynı anda birden fazla hücreleri embriyonik gelişim içinde vivosırasında izleme için ideal hala uzak olsa da. Ayrıca, voltaj duyarlı küçük moleküller de vivo içinde uygulamalar nedeniyle onların özelliklerine, hassasiyetleri ve toksisite için ideal değildir.
Çeşitli oluşturulması genetik olarak bu sorunu aşmak için yeni bir mekanizma floresan voltaj göstergelerinin (GEVIs) Teklifler kodlanmış ve düz-se bile onlar aslında sinir izlemek için istenmeyen embriyonik gelişim, eğitim kolay uygulama sağlar 2,3hücreleri. Şu anda mevcut GEVIs biri hız sensörü aksiyon potansiyelleri 1’in (ASAP1)4. Voltaj duyarlı fosfataz ve dairesel yayın derlenemiyor yeşil flüoresan protein bir gerilim algılamalı etki alanının hücre dışı bir döngü oluşur. Bu nedenle, ASAP1 hücresel elektrik potansiyel değişiklikleri görselleştirme sağlar (Polarizasyon: parlak yeşil; depolarizasyon: koyu yeşil). ASAP1 2 ms açık ve kapalı Kinetik vardır ve subthreshold olası değişiklik4izleyebilirsiniz. Böylece, bu genetik aracı gerçek zamanlı biyo-elektrik canlı hücrelerde izleme etkinliğinin yeni düzeyi sağlar. Daha fazla bioelectricity embriyonik geliştirme ve birçok insan hastalıkları, kanser gibi rollerini anlamak hastalık tedavi ve korunma için kritik olan temel mekanizmaları, yeni ışık tutacak.
Zebra balığı gelişim biyolojisi ve insan hastalıkları kanser5,6dahil olmak üzere çalışmaya güçlü bir hayvan modeli kanıtlanmıştır. Onlar % 70 orthologous genler insanlarla paylaşmak ve onlar-si olmak benzer omurgalı Biyoloji7. Zebra balığı nispeten kolay bakım, yumurta, uysal genetik, kolay transgenesis ve saydam dış embriyonik geliştirme, hangi yapmak onları vivo içinde görüntüleme5,6için üstün bir sistemi büyük debriyaj boyutunu sağlar. Bir büyük satırların kaynağı olan mutant balık zaten mevcut ve tam sıralı genom, Zebra balığı bilimsel keşif nispeten sınırsız bir dizi sağlayacaktır.
Hücreleri vivo içinde gerçek zamanlı elektriksel aktivitesinin araştırmak için Zebra balığı modeli sistemi ve ASAP1 avantajlarından yararlanın. Bu yazıda nasıl flüoresan gerilim Biyoalgılayıcı ASAP1 Tol2 transposon transgenesis kullanarak Zebra balığı genom dahil tarif ve hücresel elektriksel aktivite sırasında embriyonik gelişim, Balık larva hareketi ve canlı tümör görselleştirmek .
Protocol
Representative Results
Discussion
Her ne kadar cep ve doku düzeyinde elektrik faaliyetleri sırasında embriyonik geliştirme ve insan hastalık uzun zaman önce keşfedildi, vivo içinde dinamik elektrik değişiklikleri ve biyolojik rolleri hala büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Büyük zorluklardan biri görselleştirmek ve elektrik değişiklikleri ölçmek etmektir. Yama kelepçe teknoloji bir mola-tek hücre izlemek için geçer ancak birçok hücrelerinin oluşan oldukları için uygulama omurgalı embriyolar için sınırlıdır. Ge?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında bildirilen araştırma çalışmaları tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM124913, Purdue Üniversitesi PI4D teşvik programı ve PVM iç rekabet altında desteklenen Temel araştırma fonları programı. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka finansman ajanları resmi görüşlerini temsil etmiyor. Biz Koichi Kawakami Tol2 yapı, Michael Lin ASAP1 inşa etmek için teşekkür ederiz ve Leonard Zon ubi organizatörü için inşa Addgene.
Materials
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector mm33 rechts | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
Riferimenti
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
