準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる

1. 小胞の準備 薄膜の作製 ガス タイトな注射器を使用すると、ガラス瓶のクロロホルムに表 1.1で説明されているように脂質の一定量を転送します。 窒素またはアルゴン発煙のフードの流れの下で得られた溶液を蒸発させます。 クロロホルムの任意の残基を削除する少なくとも 2 時間家真空の結果として得られる薄膜を対象します。脂質が一晩残される真空下でこの時点で。 小胞の水分補給 カルセイン粉末 2.5 mL の 1 M トリス塩酸 pH 8.0 バッファーの 31 mg を溶解し、純水 (DI) の別の 7.5 mL の追加により 10 mL の 5 mM カルセイン 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 水和反応バッファーを準備します。 空チューブに水和バッファー上の 250 μ L をピペット、最終的な 75 mm の基本 10 M NaOH の 1.875 μ L (総脂肪酸の ½ 相当) を追加します。総脂質濃度 0.15 M のフォーム小胞に乾燥脂質薄膜にソリューションを転送します。 高速使用 (> 3000 rpm) 渦 4-5 秒の得られた混合物を vortexer。 水分補給、少なくとも一晩を低速 (約. 30 rpm) 回転シェーカーで脂質バッファー混合物を残します。 (省略可能) 小胞のサイズ変更 ピンセットを使用して、押出機の注射器ポートの各内面 1 つサポートするフィルターが適用されます。 250 mM tris 各フィルター サポートを濡れている-塩酸で pH 8。 ピンセットを使用して、押出機 O リングの 1 つに 1 つトラック エッチング 100 nm ポリカーボネート膜を適用し、サポートをフィルターします。世話ない涙や膜を穿刺、2 つのサーフェス間の良好な接触をするために o リングに膜をそっと押し込みます。 押出機、膜がずれないように世話を行い、フィルターをサポートしています。 250 mM tris の 0.5 mL と押出機の注射器を埋める-塩酸で pH 8。この注射器を押出機の 1 つの側面に挿入します。 押出機の反対側に空の注射器を挿入します。 手でゆっくりとバッファーを含む (≤ 50 μ L/s)、注射器のプランジャーを押して、トラック エッチング膜が場所、そのままを示す抵抗が感じられることを確認します。抵抗性の期待されるレベルを測定するために場所に膜なしこのステップを練習することをお勧めします。 削除し、空の注射器 2 本。リポソーム調製に同一組成のバッファーが含まれているので、この段階で注射器 2 本をきれいにする必要はありません。 注射器 2 のリポソーム調製に読み込みます。 左側にある、右側にある空の注射器に小胞サンプルの入った注射と押出機を組み立て直します。 手で非常にゆっくりと小胞サンプルの入った注射 (10-25 μ L/s) のプランジャーを押してください。 押出機の右側にある注射器を注意深く観察します。バッファーが押出機の右側にあるを入力して最初クリア (50 μ L、これは押出機の内部のデッド ボリュームのため)、押出リポソームの小さなプルームが続きます。この時点でを押してすぐに停止、押出機、右側にある注射器を取り外してこのソリューションを廃棄します。 押出機の右側にある注射器を交換し、左の注射器が空になるまでを押し出します。 押出機の向きを逆にし、手順 13 を繰り返します。必要な数のサイクル (通常 7、9、または 11) で続行します。奇数は非押し出しリポソームは最初中古小型化リポソーム調製を含む注射器から収集されないように常にされます。 優しく右注射器の内容をエッペン チューブに分注し、0.5 h 程度の低速 (約. 30 rpm) 回転シェーカーでチューブを配置します。 セクション 2 で説明した小胞浄化を続行します。押し出された小胞を 24 h 内で使用するか、再度次の時間使用する前に押し出されます。 2. 小胞浄化 小胞浄化移動相の調製 1 M トリス塩酸 pH 8 バッファー、DI 水を 15 mL ファイティングファルコン管の 3.75 mL 1.25 mL を追加して 5 mL の 250 mM トリス塩酸 pH 8 水和バッファーを準備します。10 M NaOH の 37.5 μ L を追加 (unesterified 脂肪酸基準ベースの ½ 相当) 水和反応バッファーにします。0.15 M 総脂質小胞のソリューションの結果ファルコン チューブに直接純粋なオレイン酸の 235 μ L をピペットします。 高速使用 (> 3000 rpm) 渦 4 5 s の混合物 vortexer は、少なくとも 2 時間のシェーカーを回転低速で転落。脂質準備することができます一晩残される回転のシェーカーでこの時点で。潜在的な集計を削除する使用する前に 0.22 μ m シリンジ フィルター ユニットを介して移動相をフィルター処理します。 セファローズに小胞の精製 Ca. エタノール セファローズ 4 b 液の 5 mL ボトルのピペットを使用してから削除します。10 mL の使い捨て可能なクロマトグラフィー コラムにこれを適用します。 エタノール アプローチ樹脂床の上まで解決するスラリー、エタノールの通過を許可します。 5 ml の脱イオン水樹脂とエタノールの残渣を洗い流すため let フロースルーの上部に。 適用 250 mM トリス-HCl、pH 液面樹脂ベッドの上部に近づくたびに新しい部分を適用する樹脂の上に 1-2 mL の部分で 8。リピートの 3-5 回。 レトルト スタンドに列をクランプし、活栓コネクタと分数コレクターに管列の先端に接続します。フラッシュ チューブは、列内の液体のレベルに近づくとガレージの上部、活栓を閉じてバッファーの別の部分を追加します。 セクション 1 から 200 μ L pipettor を使用して、ベシクル調製を樹脂樹脂ベッドまたは列の壁に触れることがなく、できるだけ均等に適用する世話のガレージの上に押し出された小胞を適用します。 流れを開始、96 ウェル プレートに分画の収集を開始しバルブを開きます。0.5-1 の樹脂層の上に小胞浄化移動相を適用 mL 部分バッファーを使い果たす、樹脂ベッドを乾燥しないように世話として。5 ドロップ画、少なくとも 36 井戸 (96 ウェル プレートの 3 行) を収集を収集します。 精製留分の蛍光特性 前のセクションから 96 ウェル プレート、プレート リーダーで読む (exλ = 485 nm、λem= 515 nm)。 分数の数対蛍光として得られた蛍光データをプロットします。小胞はまず、溶出カプセル化されていない部分 (図 1) が続きます。 小胞の漏洩を監視する小胞の及び再精製 セクション 2.2 と 2.3 の精製と諸性質の手順を繰り返します。その内容を保持している小胞はカプセル化されていない溶質 (または小胞ピークの強度の約 5-10% の非常に小さなもの) のピークを示さない。 3. マグネシウムの存在下での小胞の使用 リガンド非結合状態のマグネシウムの使用 準備し、セクション 1、2.1 および 2.2 で説明したように小胞を浄化します。 水・ ディ ・ 700 μ L に 1 M トリス塩酸 pH 8.0 バッファーの 250 μ L と 1 M MgCl2の 50 μ L を追加することによって 50 mM 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 緩衝 MgCl2ソリューションの 1 つの mL を準備します。よく混合する渦。 5 mM の必要なマグネシウム濃度を与えるためには、浄化された小胞の 0.9 mL とマグネシウム溶液 100 μ L を混ぜるし、マグネシウム濃度の高いローカル小胞の短期曝露によって小胞の中断を最小限に抑えるために急速にかき混ぜます。注: は、小胞の安定性に重要なマグネシウム溶液の急速混合です。マグネシウムおよび小胞はすぐに混合していない場合即時ボルテックスによって、いくつかの小胞はサンプルからサンプルに一貫性のない結果の結果マグネシウムの高濃度にさらされます。 及び再精製する前に、少なくとも 30 分間タンブラーに小胞サンプルそのままに内容漏れをチェックするための 2.4 で説明されています。及び再精製移動相に同じ小胞のサンプルのようにマグネシウム濃度を追加します。 リガンド結合状態のマグネシウムの使用 準備し、セクション 1、2.1 および 2.2 で説明したように小胞を浄化します。注: 使用 ½ 相当島脱プロトン化脂肪酸に水酸化ナトリウムの代わりにこれはキレート MgCl2システムでより安定したリポソームを生成することが見つかりました。 2 M カリウムのクエン酸溶液を準備し、島の 8.0 pH を調整します。 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 バッファーで指定された比率 (約 1:4 安定したオレイン酸小胞の) で MgCl2カリウムのクエン酸をプレミックスします。 小胞のサンプルは、簡単に渦に予混合マグネシウム クエン酸溶液を追加します。注: は、マグネシウムと配位子のソリューションを常にプレミックスします。Unchelated マグネシウム溶液だけに小胞を公開しないでください。 及び再精製する前に、少なくとも 30 分間タンブラーに小胞サンプルそのままに 2.4 で説明されています。及び再精製移動相に同じマグネシウムおよび小胞のサンプルのようにクエン酸濃度を追加します。 4. 非酵素 RNA 小胞内のコピー 単分散 RNA の調製は、小胞をカプセル化 1.1 節で説明したように乾燥オレイン酸フィルムを準備します。 50 μ M 蛍光標識 RNA プライマーと小胞復元バッファー、150 μ M RNA テンプレートおよび 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 オレイン酸を基準にして ½ 相当島を含むを準備します。 脂質膜に水分補給バッファーの 250 μ L を追加し、1.2.2 と 0.15 M 脂質濃度と小胞に 1.2.3 のステップに従います。 小型単層単分散小胞を作る、ためにセクション 1.3 小胞押出に従います。 クエン酸マグネシウム添加および小胞の浄化 マグネシウムやクエン酸株式をプレミックスし、最終的な脂質濃度 0.1 M の小胞のサンプルとこれをミックスします。 セファローズ 4 b サイズ排除カラム、250 mM トリス塩酸 pH 8.0 0.1 M 脂質およびマグネシウムと移動相としてクエン酸の小胞を浄化します。 次のセクション 2.3 で小胞の分数を収集します。 プライマー拡張反応 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 で 200 mM 2 MeImpG (グアノシン 5′-一リン酸 2-反応に対する生体) 原液を準備します。(注: フォロー以前公開プロトコル10 2 MeImpG 合成します)。 プライマー拡張反応を開始、脂質 75 mM と 50 mM の最終濃度に到達する 450 μ L 小胞サンプル 2 MeImpG 原液の 150 μ L を転送するには、モノマーを活性化。タイマーと維持反応サンプルのすべての時間をタンブリング スタート。 (省略可能)連続的な新鮮なモノマーの餌、300 μ L 構築実習少量リポソーム ダイアライザー11の一室に反応液のと他の商工会議所でのソリューションを餌入れ 300 μ L を転送します。餌のソリューションは、空胞と小胞を含む RNA の交換を除いて、反応液のように同じ濃度ですべての成分を含める必要があります。透析の各ラウンドは、アンチモンや使われる膜によって、1 24 時間かかります。 速度論的研究の各時点で 100 μ L 分注を取るし、移動相として 250 mM トリス塩酸 ph 8.0 セファローズ 4 b サイズ排除列を介して因数を repurify します。 1.5 mL エッペン チューブに小胞分数を収集します。 最後の 0.1% 程度に小胞分数にトリトンをピペット v/v。 チューブに冷たいエタノールの 0.5 mL を追加し、-20 ° C 少なくとも 2 時間インキュベートします。 16.1 × 1000 ですべてのサンプルを遠心分離機 10 分軽く、液体をピペットの rcf (16.1 × g)。RNA ペレット 70% 冷エタノールと遠心洗浄再び 5 分の液体を廃棄し、RNA ペレット管に置く残留エタノールを蒸発させるため 2 分の 80 ° C 熱ブロック。1xTBE 読み込みバッファーと 8 M 尿素を 50 μ l 添加のペレットを溶解します。 ページ解析 20% を準備 10xTBE バッファーの 25 mL、TEMED 80 μ、250 mg 過硫酸アンモニウムの濃縮物、25 mL の希釈、UreaGel システムの UreaGel システムの 200 mL を混合することによってページのゲル。すぐに固定ゲル平板 (35 cm × 45 cm) 間ゲル混合物を注ぎ、櫛を挿入します。完全な重合まで少なくとも 30 分待ちます。 ゲルのスタンドの上にゲル板を組み立てるし、1xTBE ゲルの実行バッファーでゲル ボックスを埋めます。櫛離陸し、注射器で井戸をフラッシュします。60 W 30 分でゲルを実行済み。 2 分の 80 ° C の熱ブロックのサンプルを加熱し、5 μ L/ウェル各サンプルをロードします。 ゲルのパワー ボックスをオンにし、ゲルの 2.5 h の 60 W で定ワットを実行を設定します。 ゲル スタンドからゲル板を分解、ガラスをきれいに拭くし、ゲルのスキャンを開始するゲル スキャナーで全体の板を置きます。 ImageQuant TL 1 次元解析とゲルを定量化します。プライマー プライマー対時間の初期量に与えられた時点で残りの量の比の自然対数をプロット、線に合わせるし、擬似最初順序反作用率 (図 2) を計算します。 5 小胞の RNA の自己胸の谷間ハンマー ヘッド 小胞にカプセル化されたリボザイムの合成と精製 脂質薄膜を準備 (OA: GMO = 9:1) のコンポーネントと同様に、1.1 節のように表 1.2.注: 使用する前に完全な溶解の少なくとも 60 の ° c の暖かい GMO。 各ハンマー ヘッド型リボザイム ストランドと 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 の 5 μ m の小胞水分補給バッファーを準備します。 脂質膜に水分補給バッファーの 250 μ L を追加し、手順 1.2.2 と 0.15 M と小胞を合計する 1.2.3 脂質濃度に従います。 小型単層単分散小胞を作る、ためにセクション 1.3 小胞押出に従います。 250 mM トリス塩酸 pH 8.0、0.15 M を持つ、セファローズ 4 b サイズ排除列移動相として脂質の混合ベシクルを浄化します。 ハンマー ヘッド型リボザイム自己開裂反応 マグネシウム溶液を準備し、自己開裂反応を開始するセクション 3.1 で説明されているように精製された小胞でミックスします。 速度論的研究の各時点で混合物の 100 μ L を取るし、移動相として 250 mM トリス塩酸 ph 8.0 セファローズ 4 b サイズ排除列を介してこの因数を直接 repurify。小胞の分数を収集します。 ページ解析 RNA サンプルの読み込みを準備する 4.3.6 4.3.8 に手順に従います。 ジェル ボックスに商業的キャスト 15 %tbe 尿素ゲルを置き、1xTBE ゲルの実行バッファーをゲルのボックスに入力します。 1 分の 80 ° C の熱ブロックのサンプルを加熱し、5 μ L/ウェル各サンプルをロードします。 約 1 h の定数 200 V でゲルを実行します。 ゲルをスキャンします。 ImageQuant TL 1 D のような解析ソフトウェアとゲルを定量化、残りの強さを比較することによって胸の谷間の程度を測定する基板 RNA バンドと切断 RNA フラグメント バンド (図 3)。 6. 巨大な脂肪酸小胞を顕微鏡 巨大な脂肪酸小胞の準備 1.1 節、表 1.3よい膜観察のための蛍光に分類された脂質 0.2 mol % オレイン酸薄膜を準備するに従ってください。 500 μ L 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 小胞サンプル 10 mM 脂質は、合計すると脂質膜を水分補給します。必要な場合、バッファーは蛍光染料または RNA 分子を含むかもしれない。小胞サンプル タンブリング一晩おきます。 オレイン酸の 470 μ、250 mM トリス塩酸 ph 8.0 ½ 相当 NaOH を含む 150 mL を混合することによって総脂質の 150 mL の 10 ミリメートルと純粋な脂肪酸透析バッファーを準備します。 大きな凝集体を削除する 10 μ m ポリカーボネート膜小胞サンプルを押し出します。 1 μ m 大孔径透析カセットには、前述のように小胞サンプルを転送します。12 30 mL 透析バッファーを含む 100 mL のビーカーに透析カセットを配置します。テーブル トップ シェーカー 80-100 rpm で静かにビーカーを揺り動かしなさい。 透析バッファー無料染料または RNA および小さい小胞を削除する 5 回の 30 分毎に変更します。 エッペン チューブに注射器と転送、透析カセットからの小胞サンプルを削除慎重に。 顕微鏡観察 きれいな標準的な顕微鏡スライド上に小胞の 10 μ L をピペット、サンプル上ガラス製カバー スリップを配置します。透明なマニキュアでカバーガラスをシールします。 油分散または同様の客観的 X 60 の小胞を膜の蛍光標識した RNA やカプセル化された色素 (図 4)、適切なレーザーを用いた共焦点顕微鏡による観察します。