Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung
Summary
Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.
Abstract
Biofilmbildung ist ein dynamisches, mehrstufigen Prozess, der in Bakterien unter rauen Umgebungsbedingungen oder Stresssituationen auftritt. Für enterischen Krankheitserregern wird eine erheblichen Stress-Reaktion während des Magen-Darm-Transports und nach Galle Exposition, ein normaler Bestandteil des menschlichen Verdauung induziert. Um die bakterizide Wirkung der Galle zu überwinden, bilden viele Enterische Krankheitserregern einen Biofilm Hypothese um zu überleben zu ermöglichen, beim Transit durch den Dünndarm. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Biofilmbildung durch Einhaltung der Festphasen-Assays sowie extrazellulären Polymeren Substanz (EPS)-Matrix-Erkennung und Visualisierung zu definieren. Darüber hinaus ist Biofilm Dispersion Bewertung vorgelegt, um die Analyse der Ereignisse, die Freisetzung von Bakterien bei der Infektion auslösen zu imitieren. KRISTALLVIOLETT Färbung wird verwendet, um anhaftenden Bakterien in einem Hochdurchsatz-96-Well-Platte Einhaltung Assay zu erkennen. EPS Produktion Bewertung ergibt sich aus zwei Assays, nämlich Mikroskopie Färbung der EPS-Matrix und semi-quantitative Analyse mit einem eindringmittel konjugierte Polysaccharid bindende Lektin. Zu guter Letzt wird Biofilm Dispersion durch Kolonie zählt und Plattieren gemessen. Positive Daten aus mehreren Tests unterstützen die Charakterisierung von Biofilmen und können genutzt werden, um Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in andere Bakterienstämme zu identifizieren.
Introduction
Biofilmbildung ist eine wichtige bakterielle Überlebensstrategie induziert bei rauen Umgebungsbedingungen. Exposition gegenüber bakterizide Verbindungen wie Antibiotika oder Änderungen an Nährstoff oder sauerstoffverfügbarkeit induziert einen gestressten Zustand in Bakterien, die durch Biofilmbildung gelindert werden können. Ein Biofilm zeichnet sich durch bakterielle Bindung an eine Oberfläche oder andere Bakterien und wird begleitet durch die Sekretion von einer EPS-Matrix bestehend aus hauptsächlich Polysaccharide1,2,3. Biofilmbildung ist ein dynamischer Prozess, in dem eine Kaskade von Ereignissen in Bildung eines ausgereiften anhaftende Bakteriengemeinschaft1,2,3gipfelt. Bakterien produzieren Adhesins um die frühe Bindung während der Verschiebung adhäsin gen expressionsprofile zur Stärkung der Anlage während der Reifung der Biofilm zu erleichtern. Gleichzeitig tritt die EPS-Produktion zu beschichten der Bakteriengemeinschaft in einer Matrix, die Zellen vor den ersten Stressor zu schützen. Der Biofilm enthaltene Bakterien sind langsam wachsend; und als solche die meisten Antibiotika unwirksam macht. Darüber hinaus spart das langsame Wachstum Energie, bis Bedingungen ändern, um bakterielles Wachstum1,2,3bevorzugen. Nach die harten Bedingungen bestanden haben, Bakterien den Biofilm zu zerstreuen und wieder planktonischen Lebensweise1,2,3. Traditionell, Biofilmen auf Oberflächen eingehalten werden und eine anhaltende klinische Herausforderung wegen Infektion Stauseen auf Katheter und in Wohnung Geräte1,2,3vorhanden.
Biofilmbildung wurde kürzlich für mehrere magensaftresistenten Krankheitserreger beschrieben; Bakterien, die den Dünndarm oder Dickdarm4infizieren. Shigella -Arten, tritt Infektion im menschlichen Dickdarm nach einer Durchreise durch die Mehrheit des Magen-Darm-Trakt. Während der Passage durch den Dünndarm ist Shigella Galle ausgesetzt; ein Lipid-abbauenden Waschmittel abgesondert in den Darm zur Verdauung von Lipiden während gleichzeitig töten die meisten Bakterien5zu erleichtern. Enterische Krankheitserregern haben die einzigartige Fähigkeit, die bakterizide Wirkung der Galle6widerstehen. Unsere jüngsten Analyse verwendet in-Vivo-wie Kombinationen aus Glukose und Gallensalze, robuste Biofilmbildung in S. Flexneri demonstrieren sowie anderen Arten von Shigellen, pathogene Escherichia coliund Salmonellen4. Zuvor, Salmonella Enterica Serovar Typhi gezeigt werden konnte, bilden einen Galle-induzierte Biofilm durch einzigartige Besiedlung der Gallenblase während der chronischen Infektion7,8,9, 10. Darüber hinaus vorherige Forschung mit Vibrio11und Campylobacter12 gezeigt Biofilmbildung auf Galle. Daher die Analysen erweitert die Galle-induzierte Biofilm Formation Beobachtungen auf andere Krankheitserreger und helfen, um Demonstration der konservierten magensaftresistenten Erreger Antwort auf Galle zu etablieren. Im Gegensatz zu chronischen Biofilme in der bakteriellen Gentranskription ist begrenzt und Zelle Seneszenz kann auftreten,1,2,3schlagen wir vor, dass der Magensaftresistente Galle-induzierte Biofilm in der Natur mehr vergänglich ist. Diese vorübergehende virulenten Biofilm ist geprägt durch eine schnelle Demontage (gesehen in der Dispersion-Assay) und verbesserte Virulenz Genexpression beobachtet in den Biofilm Bevölkerung4,6.
Wie Biofilmbildung eine facettenreiche, dynamischer Prozess und die Verwendung von Gallensalzen wie ein auslösende Faktor für die meisten enterischen Krankheitserregern nur vor kurzem beschrieben ist, sind die Werkzeuge und Techniken, die einzigartige und kreative Anwendungen der traditionellen Methoden. So sind die hier vorgestellten drei kostenlose Strategien, mehrere wichtige Eigenschaften der Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erwachsenden bakterielle, Produktion von EPS-Matrix und Dispersion von lebensfähigen Bakterien von den Biofilm zu quantifizieren. Diese Techniken wurden in erster Linie für die Forschung mit Shigellagenutzt; und Bewertung der anderen enterischen Krankheitserregern erfordern daher, Optimierung. Dennoch positive Daten aus allen drei Tests unterstützen Identifikation von Biofilmen und reproduzierbare Protokolle für die Galle Salz-induzierte Biofilmbildung einführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse der Biofilmbildung ist schwierig wegen der dynamischen Natur von Biofilmen und die Variabilität zwischen Stämmen, Materialien, Labors und Tests. Hier sind mehrere Strategien vorgestellt, um Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern nach Gallensalze Exposition mit experimentellen Erkenntnisse zur Förderung der Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Es gibt weitere Überlegungen zur Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. In allererster Linie, empfehlen wir die Durchführung von mindestens drei unabhängigen Expe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Rachael B. Chanin und Alejandro Llanos-Chea für technische Hilfe. Wir danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski und Bobby Cherayil für die Stämme, die in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy und ansteckende Krankheiten Grant K22AI104755 (C.S.F.) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
Riferimenti
- Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
- Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
- Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
- Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
- Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
- Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
- Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
- Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
- Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
- Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
- Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
- Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
- Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
- Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
- Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
- Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
- Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
- Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
- Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
- Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
- Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
- Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
- de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
- Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
- Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
- Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
- Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
- McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
- Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
- Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
- Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
- Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
- Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
- Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).
