Protocolo de aguda y crónica pruebas de ecotoxicidad de los killis turquesa Nothobranchius furzeri
Summary
En este trabajo describimos un bioensayo agudo, crónico y multigeneracional para estudiar los efectos de los estresores individuales y combinados en los killis turquesa Nothobranchius furzeri. Este protocolo está diseñado para estudiar características de historia de vida (mortalidad, crecimiento, fecundidad, peso) y máximo térmico crítico.
Abstract
Los killis Nothobranchius furzeri es un organismo modelo emergente en el campo de la ecotoxicología y ha demostrado su aplicabilidad en las pruebas de ecotoxicidad aguda y crónica. En general, la sensibilidad de las especies a los compuestos tóxicos es en la gama, o más, que otras especies modelo.
Este trabajo describe los protocolos de bioensayos agudos, crónicos y multigeneracionales de efectos individuales y combinados estresor en N. furzeri. Debido a su tiempo de maduración corta y ciclo de vida, este modelo vertebrado permite el estudio de como tiempo de maduración y fecundidad dentro de cuatro meses. Ensayos de exposición de todo el ciclo de vida transgeneracional se pueden realizar en tan poco como 8 meses. Puesto que esta especie produce huevos que son resistentes a la sequía y permanecer viable durante años, el cultivo in situ de las especies no es necesario pero los individuos pueden ser reclutados cuando sea necesario. Los protocolos están diseñados para medir rasgos de historia de vida (mortalidad, crecimiento, fecundidad, peso) y máximo térmico crítico.
Introduction
Perfiles de sensibilidad de una gran variedad de especies a sustancias tóxicas estratégicamente seleccionados han sido descritos1 para la legislación de alcance europeo (registro, evaluación, autorización y restricción de productos químicos). Pruebas de toxicidad aguda o a corto plazo se utilizan principalmente para este propósito ya que dan una indicación rápida de la sensibilidad de una especie. Sin embargo, en su ambiente natural, los organismos están expuestos durante períodos mucho más prolongados y ciclo de vida completo o incluso varias generaciones podrían ser afectado2. Además, organismos en ambientes contaminados por lo general están expuestos a más de un factor estresante a la vez, que puede interactuar con los demás, posiblemente dando por resultado efectos sinérgicos3. Por lo tanto, concentraciones seguro calculado estresor agudo, solo en base a las pruebas de toxicidad pueden subestimar los riesgos reales impuestos por sustancias tóxicas en ambientes naturales. Por lo tanto, es conveniente también estudiar los efectos crónicos y multigeneracionales de concentraciones subletales de sustancias tóxicas en un contexto ambientalmente relevante como defendido por la Comisión Europea4,5 y la USEPA (United Agencia de protección ambiental de los Estados)6,7. Especialmente en la investigación vertebrada, los costes en términos de mano de obra, tiempo y dinero son altos cuando se realizan estudios de exposición crónica y múltiples generaciones debido a la vida útil relativamente larga de los vertebrados frente a los organismos modelo de invertebrado. Por lo tanto, es aconsejable elegir el organismo de modelo más apropiado de pescado, dependiendo de la pregunta de investigación. Además, una amplia gama de especies de vertebrados debe estar disponible para poner a prueba la generalidad de las respuestas a través de especies para poder adaptar reglamentos basados en las especies más sensibles. Por ahora, hay una necesidad de desarrollar nuevos protocolos eficientes con especies de vertebrados modelo caracterizados por ciclos de vida cortos para bajar los costos de realizar exposiciones crónicas y multigeneracionales en vertebrados7,8.
Los killis turquesa Nothobranchius furzeri es un interesante modelo de pescado para utilizar en tales experimentos de exposición a largo plazo debido a su tiempo de maduración corta y ciclo de vida (tiempo de generación menor de 4 semanas9). Esto significa que se pueden estudiar dentro de un marco de tiempo corto comparado con otros modelos de pescado7extremos ecológicamente relevantes como tiempo de maduración y fecundidad. Además, estos peces producen huevos resistentes a la sequía, latentes que permanecen viables durante varios años cuando se almacena bajo condiciones estándar, eliminando así la necesidad de una cultura continua9. En estudios ecotoxicológicos, esto también implica replicar peces pueden todos ser tramados en el momento exacto de la misma, resultando en sincronía de tiempo para todos los animales, incluso entre lotes de huevos producidos en diferentes épocas. Aconsejamos utilizar el laboratorio cepa GRZ para realizar experimentos de exposición. Esta variedad funciona bien bajo condiciones de laboratorio, es homocigótica (excepto los cromosomas sexuales) y el genoma es bien caracterizado10,11.
En estudios ecotoxicológicos, es importante seleccionar el rango de concentraciones de ensayo apropiado. Varios métodos complementarios pueden utilizarse para este fin. La gama de concentración nominal puede basarse en la sensibilidad de una especie relacionada, como Nothobranchius guentheri12. Por otra parte, la gama puede basarse en la sensibilidad de los modelos estándar de peces, como el pez cebra (Danio rerio)2 que tiene una sensibilidad comparable a la mayoría de sustancias tóxicas (Philippe et al. (en revisión)). En combinación, con dos de estas opciones, deberá realizarse un experimento Rangefinding para seleccionar el rango de la concentración nominal. Para el análisis agudo, investigadores deberían apuntar para los tratamientos de concentración con 100% de mortalidad, mortalidad intermedia y 0% de mortalidad después de 24 h de exposición a la sustancia tóxica. Para pruebas crónicas, es recomendable ejecutar el Rangefinding experimento durante dos semanas verificar si mortalidad larvaria en la condición con las concentraciones más altas de la prueba no exceda del 10% durante este período de referencia.
El protocolo puede servir como base para realizar la exposición aguda y crónica a contaminantes transmitidas por el agua en N. furzeri, examinar los posibles efectos de los estresores a nivel individual y celular. También puede ser utilizado para realizar investigaciones multi-estresor para dar cabida a una mayor relevancia ecológica, mezcla de diferentes compuestos tóxicos o estudiar los efectos interactivos entre la contaminación y otros factores de estrés naturales (p. ej. depredación) o antropogénico factores de estrés (p. ej. calentamiento debido al cambio climático).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo describe un nuevo bioensayo usando Nothobranchius furzeri, un organismo modelo emergente, para estudiar al individuo y combina efectos a largo plazo de sustancias tóxicas y otros estresores. Los protocolos presentados fueron aplicados con éxito para medir la sensibilidad de las especies a una gran variedad de sustancias tóxicas (cobre, cadmio, 3, 4-dicloroanilina y clorpirifos). Debido a su rápido ciclo de vida, este modelo vertebrado permite evaluación de subletales y efectos transgeneracional…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al grupo de la esfera de la UAntwerpen y el Departamento de protección de cultivos de todo el análisis de muestras de agua. Durante este proyecto fue apoyado por el centro de excelencia ‘ Eco y dinámica socio-evolutiva (PF/10/007) del fondo de investigación de KU Leuven. AFG (11Q0516N) y ESJT (FWO-SB151323) fueron financiados como doctorado y TP (12F0716N) como becario post-doctoral por FWO Flandes (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).
Materials
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
Riferimenti
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