Protokoll für akute und chronische Ökotoxizität Prüfung von Türkis Killifische Nothobranchius furzeri
Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir eine akute, chronische und Mehrgenerationen Bioassay zur Untersuchung der Auswirkungen von Einzel- und kombinierte Stressoren auf die türkisfarbene Killifische Nothobranchius Furzeri. Dieses Protokoll dient zur Lebensgeschichte Züge (Mortalität, Wachstum, Fruchtbarkeit, Gewicht) und kritische thermische Maximum zu studieren.
Abstract
Killifische Nothobranchius Furzeri ist eine aufstrebende Modellorganismus auf dem Gebiet der Ökotoxikologie und ihre Anwendbarkeit bei akuten und chronischen Ecotoxicity Tests nachgewiesen. Insgesamt ist die Empfindlichkeit der Spezies zu toxischen Verbindungen im Bereich mit, oder höher als die der anderen Modell-Arten.
Diese Arbeit beschreibt Protokolle für akute, chronische und Mehrgenerationen Bioassays Einzel- und kombinierte Stressor Auswirkungen auf N. Furzeri. Aufgrund seiner kurzen Reifezeit und Lebenszyklus erlaubt dieses Wirbeltiere Modell die Studie von Endpunkten wie Reifezeit und Fruchtbarkeit innerhalb von vier Monaten. Transgenerationalen Ökobilanz-Belichtung Studien können in weniger als 8 Monaten durchgeführt werden. Da diese Sorte produziert Eizellen, die Trockenheit sind und bleiben für Jahre lebensfähig, die vor-Ort-Kultur der Arten ist nicht erforderlich, aber Einzelpersonen können rekrutiert werden, wenn erforderlich. Die Protokolle sind auf Maß Lebensgeschichte Züge (Mortalität, Wachstum, Fruchtbarkeit, Gewicht) und kritische thermische Maximum konzipiert.
Introduction
Empfindlichkeit-Profile aus einer Reihe von Arten, strategisch ausgewählten Schadstoffen wurden beschrieben1 für die europäischen REACH-Gesetzgebung (Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung von Chemikalien). Akute oder kurzfristige Toxizitätstests wurden meist für diesen Zweck eingesetzt, da sie einen schnellen Hinweis auf eine Art Sensibilität geben. Jedoch in ihrer natürlichen Umgebung Organismen sind über einen viel längeren Zeitraum ausgesetzt und vollständigen Lebenszyklus oder sogar mehrere Generationen möglicherweise betroffenen2. Darüber hinaus sind Organismen in verschmutzter Umgebung in der Regel ausgesetzt mehr als ein Stressor in einer Zeit, die miteinander interagieren kann, wodurch möglicherweise die synergistische Effekte3. Daher können sichere Konzentrationen berechnet basierend auf akute, einzelne Stressor Toxizitätstests unterschätzen die tatsächlichen Risiken von Schadstoffen in natürlichen Umgebungen. Es ist daher ratsam, auch die chronischen und Mehrgenerationen subletalen Konzentrationen von Schadstoffen in einem ökologisch relevanten Kontext untersuchen wie von der Europäischen Kommission4,5 und USEPA (United befürwortet States Environmental Protection Agency)6,7. Vor allem in vertebrate Forschung sind die Kosten in Bezug auf Arbeit, Geld und Zeit hoch, bei chronischen und Mehrgenerationen Belichtung Studien wegen der relativ langen Lebensdauer der Wirbeltiere im Vergleich zu Wirbellosen Modellorganismen. Daher ist es ratsam, die am besten geeignete Fische Modellorganismus, je nach Fragestellung wählen. Darüber hinaus sollte eine breite Palette von Wirbeltieren zur Verfügung, um die Allgemeingültigkeit der Antworten über Artgrenzen Regelungen basierend auf den empfindlichsten Arten anpassen können zu testen. Denn jetzt gibt es eine Notwendigkeit zur Entwicklung neuer, effizienter Protokolle mit vertebrate Model Art zeichnet sich durch kurze Lebenszyklen, senken Sie die Kosten für die Durchführung von chronischen und Mehrgenerationen-Risiken auf Wirbeltiere7,8.
Die türkisfarbenen Killifische Nothobranchius Furzeri ist ein interessantes Modell der Fisch in solchen langfristigen Exposition Experimenten wegen seiner kurzen Reifezeit und Lebenszyklus (weniger als 4 Wochen9Generationszeit) zu verwenden. Dies bedeutet, dass ökologisch relevanter Endpunkte wie Reifezeit und Fruchtbarkeit innerhalb eines kurzen Zeitraums im Vergleich zu anderen Fisch Modelle7studiert werden können. Außerdem produzieren diese Fische Trockenheit, ruhende Eizellen, die für mehrere Jahre lebensfähig, wenn unter normalen Bedingungen, wodurch die Notwendigkeit für eine kontinuierliche Kultur9gespeichert bleiben. Ökotoxikologische Untersuchungen bedeutet dies auch, dass replizieren, die Fische alle zum exakt gleichen Zeitpunkt ausgebrütet werden können was Zeit synchron für alle Tiere, auch unter den Chargen von Eiern zu unterschiedlichen Zeiten. Wir empfehlen das Labor GRZ Stamm Belichtung Experimente durchführen. Diese Belastung führt auch unter Laborbedingungen, ist homozygot (mit Ausnahme der Geschlechtschromosomen) und das Genom ist gut charakterisierten10,11.
In Ökotoxikologische Untersuchungen ist es wichtig, den entsprechenden Testkonzentrationen auszuwählen. Verschiedene ergänzende Methoden können zu diesem Zweck verwendet werden. Der nominale Konzentrationsbereich kann auf die Empfindlichkeit von einer verwandten Art, z. B. Nothobranchius aus12beruhen. Alternativ kann die Reichweite basieren auf die Empfindlichkeit des standard Fisch Modelle, z. B. Zebrafisch (Danio Rerio)2 , die eine vergleichbare Sensibilität für die meisten Giftstoffe (Philippe Et al. (im Rückblick)). In Kombination mit beiden Optionen sollte ein Experiment zur Dosisfindung durchgeführt werden, um die sollkonzentration Bereich auszuwählen. Für akute testen, sollten Forscher Konzentration Behandlungen mit 100 % Mortalität, zwischen Mortalität und 0 % Mortalität nach 24 Stunden nach der Exposition gegenüber der Schlüpfzeit anstreben. Für chronische testen, empfiehlt es sich, laufen die Dosisfindung Experiment für zwei Wochen zu überprüfen, ob larval Sterblichkeit in der Bedingung mit der höchsten Testkonzentrationen 10 % während dieses Bezugszeitraums nicht übersteigt.
Das Protokoll dient Prüfung potenzielle Auswirkungen der Stressoren auf individueller und zellulärer Ebene als Grundlinie, akute und chronische Exposition gegenüber Wasser Schadstoffe auf N. Furzeri, durchzuführen. Es kann auch verwendet werden, um Multi-Stressor Forschung angepasst eine höhere ökologische Relevanz, Mischen von verschiedenen toxischen Verbindungen oder Studium der Wechselwirkungen zwischen Luftverschmutzung und andere natürliche Stressoren (z.B. Raub) durchzuführen oder anthropogene Stressoren (z. B. Erwärmung infolge des Klimawandels).
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit beschreibt eine neue Bioassay mit Nothobranchius Furzeri, einer aufstrebenden Modellorganismus, um das Individuum zu studieren und langfristige Auswirkungen der Giftstoffe und andere Stressfaktoren kombiniert. Die vorgestellten Protokolle wurden erfolgreich eingesetzt, um die Empfindlichkeit der Gattung in ein Array von Schadstoffen (Kupfer, Cadmium, 3,4-Dichloroaniline und Chlorpyrifos) zu messen. Aufgrund seiner schnellen Lebenszyklus dieses Wirbeltiere Modell ermöglicht eine Beurteilung der subl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, die Kugel-Gruppe von der UAntwerpen und der Abteilung für Pflanzenschutz an der dringend für die Analyse von Wasserproben. Unterstützung bei diesem Projekt wurde von der Excellence Center bereitgestellt “Eco und sozio-evolutionäre Dynamik des Forschungsfonds KU Leuven (PF/10/007). AFG (11Q0516N) und ESJT (FWO-SB151323) wurden als Doktoranden gefördert und TP (12F0716N) als Post-Doktorand von FWO Flanders (Fonds Wetenschappelijk verwendet).
Materials
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
Riferimenti
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