人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞

1. シリコーン解毒 254 μ m 厚い、30.48 × 30.48 cm シリコーン膜をかみそりの刃とアクリルのテンプレートを使用して 7.5 cm × 11 cm の長方形にカットします。10 長方形膜の各シートで作ることができます。シリコーンに付属している用紙を節約します。 ガラスの石鹸 (DI) 純水の浴槽で膜を配置します。1 つずつ、スクラブ、少なくとも 20 の手袋をはめた指先で精力的に膜 s またはディップまで。 Lathered の石鹸が目に見えて削除されるまで・ ディ ・流水の下で膜を洗い流してください。(包装) から紙と重力サイクル オートクレーブに膜を置きます。 ポリプロピレンなどのエタノールと反応しない素材から作られたコンテナー 24 時間使用の 60 rpm で軌道シェーカーで膜あたり 70% のエタノールの 250 mL の各シリコーン膜を浸漬します。 複数膜は単一のビンに配置されます膜箱の下部に固執する場合や、プラスチックのピペット チップとその環境から膜を分離し、ピペット チップ ラック。 手袋をはめた手でシリコン膜を膜ごと・ ディ ・水 250 mL に転送し、60 rpm で 48 時間軌道シェーカーで浸る。 紙と 4 h 93 ° C ガラス オーブンの場所に膜を置きます。 膜をほこりから身を守るために、紙の別のシートで覆われている紙で、清潔で乾燥した場所に保存します。 2. プレートの製作 プラズマ治療 200 W プラズマの 96 ウェル プレート トップ クリーナー (材料表参照) 60 s ハイパワー クリーナー下部サイドアップ プラズマ内に配置。効果的なプラズマが形成されることを示しますの部屋の窓から見える紫の輝きを確認します。この接合技術は Sunkaraらから適応14 60 s、1.5% (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシラン (APTES) 20 分水に 200 mL にプレート上部下部側ダウン。このソリューションは安定した: 60 以上準備 s プレートを導入する前に。注意: は、ヒューム フードの APTES と動作します。 プラズマ クリーナー 60 プラズマで抽出されたシリコーン膜を扱うハイパワー s。手順 2.2 で 20 分の期間の終わりの前に 5 分以上を完了するようにプラズマ処理を時間します。 鉗子を使用して、7.5 x 11 cm2羊皮紙紙の四角形の上にプラズマ処理膜を配置します。7.5 cm × 11 cm × 0.5 cm アルミニウム スラブ プレート作製クランプの下の部分に合わせます。鉗子を用いたアルミニウム スラブのシリコン膜と羊皮紙紙に合わせます。メモ: このデバイスのコンピューター支援設計 (CAD) ファイル、補助コード ファイルとして補足資料に提供されて ‘ プレス金型 – 汎用 3 D。ステップ ‘。材料の関連法案を提供補足表 1: カスタム内蔵デバイス – BOM.xlsx。 APTES バスからプレート トップを外し、余分なソリューションを振り払います。5 s の余分な水を振る 200 mL ・ ディ ・水浴に浸し。5 s と余分な水分を振り切るのため異なる 200 mL ・ ディ ・水浴に浸し。別の板の上部を浸漬する前にこれらの浴室の水を交換してください。 プレートの上部を完全に乾燥するのにには、圧縮空気を使用します。 プレート作製クランプの上部にプレート上を配置します。プレート トップ シリコーンを一緒に押すプレート作製クランプをそっと閉じます。少なくとも 1 時間クランプ。 粉塵からの保護、使用する前に室温で 24 時間を治すためにプレートを許可します。 3. ストレッチ プレート 圧子押込みをクリーンアップします。注: は、補足の図 1を参照してください。 Di では超音波発生装置 60 W お風呂スタイルに常温の水を準備します。 42 kHz で 8 分の圧子押込み超音波照射、圧子押込みの上部だけがの少なくとも 1 mm. の深さに水中に沈むように反転超音波発生装置バス上圧子ブロックのサポート 打撃は乾燥圧縮空気で圧子です。 圧子ブロックを合わせます。 それは圧子配列を見下ろしては、ライブフィード ストレッチ デバイス上のカメラを位置します。圧子押込みのトップスに焦点を当てます。注:「膜ストレッチの特徴」のセクション 4 で説明されているセットアップはこのタスクの 1 つの可能なカメラのセットアップです。 段階クランプ (図 1) を使用して損傷デバイスの段階でプレートを固定し、デバイスのドーム ライトを配置します。注: は、計測器制御ソフトウェアのための材料の表を参照してください。 傷害のデバイスを制御するコンピューターのデスクトップ上のソフトウェアのアイコンをクリックして計測器制御ソフトウェアを起動します。”In_vitro_neurotrauma.lvproj”プロジェクトを実行するには、起動ウィンドウでそれをクリックします。プロジェクト ウィンドウからモーション コントロールを起動し、名前は ‘motion_control.vi’ と ‘position_tracker.vi’、それぞれ、それらをダブルクリックするとトラッカー仮想楽器 (VIs) を配置します。 檻に囲まれて傷害デバイスを閉じます。VI が VI を実行し、ダイヤモンドの圧子を接触の 2 mm 以内にステージを下げるための ‘近く下’ をクリックするモーション コントロールの左上隅の「矢印」ボタンを押します。VI を停止する ‘停止’ ボタンをクリックします。注意: ケージでカメラを操作するときは、手は担架のクリアします。ケージのドアを閉じたときにのみストレッチ デバイスに電力を供給するドアスイッチと合うべきであるケージ。 [プロジェクト] ウィンドウで、右クリック「軸 1′ します。「対話型テスト パネル」をクリックしてします。ウィンドウが開いたら、「ターゲット位置」フィールドに ‘500’ ユニットを入力して 50 μ m のステップ サイズを設定します。 まずプレートまで繰り返し「インタラクティブ テスト パネル」ウィンドウの下部にボタンが緑に行く」をクリック任意の圧子押込みに接触。カメラによって表示されるライブ イメージからのお問い合わせを確認します。注垂直ステージ位置で報告された「インタラクティブ テスト パネル」ウィンドウの左上にこれは、最初の接触位置です。 すべての井戸が作られたまで低い (前述の 3.2.6 の手順で) をさらに、圧子と接触。必要に応じて、全体の板を見るし、(否定的な「ターゲット位置」を指定する) でステージを移動するカメラを移動し、下。垂直ステージ位置報告メモ ウィンドウの左上のすべての記事 (これは完全な接触の位置) 接触しているとき。 最初の接触および完全な接触の位置の違いに注意してください。対話型テスト パネルを閉じます。「運動制御 VI’ を実行 (手順 3.2.4 参照) ‘Top’ ステージを上げる] をクリックします。’停止’ ボタンに動き制御 VI を停止します。 舞台は、その旅行の上部には、一度は、デバイスを無効にするドアを開きます。圧子ブロックの四隅のネジを設定を調整します。お問い合わせ最初に、それを下げるし、連絡先をしたコーナーを高めるために反対のネジ締めをしたコーナーのセットのネジを緩めます。 プレート接触、舞台の引き上げの傾きの連絡先の画像を検査インデンター (ステップ 3.2.9) を調整する、圧子をブロックまでステージを下げることのプロセスを繰り返します。すべての圧子押込みになるステージとブロックが配置されると、すぐにお問い合わせください。 デバイスを非アクティブ化への扉を開きます。タイダウン ネジを圧子ブロックの穴に挿入して締め付けてください。ブロックが場所 (手順 3.2.4-3.2.8) でタイダウン ネジでレベルを確認します。プレートを作るときに「対話型テスト パネル」によって報告されるステージ位置の注意してくださいお問い合わせ。インデントの実験のためのゼロの位置となります。 圧子押込みを塗ります。 圧子ブロックだけ設定されているまだ潤滑されていない場合は、きれいに固体ゴム製パッド (7.5 cm × 11 cm × 1.5 mm) とソフト、クローズドセル発泡ゴム パッド (7.5 cm × 11 cm × 3 mm) ラボのエタノールに浸したワイプで。乾燥空気にそれらを許可します。 コーン油にラボ ワイプを浸漬し、鈍い輝きに固体ゴム製パッドの上に 。 泡パッドにオイルを転送する固体ゴム製パッドに泡パッドを配置します。7.5 cm × 11 cm × 泡パッドの上に 0.5 cm アルミニウム スラブを配置し、バラスト重量約 360 g (例えば、45 ml の水各ロード 6 円錐管) を読み込むという泡パッドに固体ゴム製パッドから油の一貫した転送を確実にします。10 許可発泡ゴム製パッドに転送する石油のための s。 圧子配列上に発泡ゴム製パッドを移動します。アルミニウム スラブと、ダイヤモンドの圧子の先端にオイルの安定した転送を確保するためその上にバラストの重量を配置します。10 許可、圧子押込みに転送する石油のための s。 圧子ブロックがセットアップされ、初めて潤滑ので板が伸縮されてない、実験を開始する前にテスト プレートをストレッチします。注: これにより、防ぐ最初のストレッチと後続の伸張の間に矛盾がある実験を交絡します。その後ストレッチ、各ストレッチの前にのみ手順 3.3.2-3.3.5 を繰り返します。 プレートをストレッチします。 ステップ 3.3 で説明したように、圧子押込みを塗ります。 傷害デバイスのステージでステージのクランプでプレートを固定します。滅菌が必要な場合は、部屋の空気に文化面をさらすことがなくプレートを保護する蓋の位置を調整します。 ‘モーション制御 VI を使用してゼロ位置にステージを下げる’ (3.2.4-3.2.6 の手順を参照)。ゼロ位置は、3.2 の手順で決定されます。 そのウィンドウの左上隅の「矢印」ボタンで実行し一意のファイル名に ‘位置の追跡 VI’ で「ファイルのパス」フィールドにファイル名を変更。 深さとインデントの期間を設定 (通常 1 から 4 ミリメートル、30 ms、それぞれ、最大深さ 5 mm の最小期間 15 ms) ‘傷害 (mm)’、’ 損傷時間 (ms)’ ‘移動コントロール パネル VI’ フィールドをクリックし、目的の入力欄値。 ‘移動コントロール パネル VI’ を実行し、「傷害」プレートをインデントするをクリックします。 ‘Top’ をクリックしてその旅行の頂上までステージを移動します。’停止’ ボタンを持つ VI を停止し、ドアを開くことによって傷害のデバイスを非アクティブ化します。 指定した最大距離が適用されたことを確認する ‘位置の追跡 VI’ の舞台の変位履歴を確認します。グラフを右クリックし、[Excel にエクスポート] をクリックします。クリックして ‘ ファイル |保存 ‘ データを保存します。 4. 膜ストレッチの特徴 高速度撮影のコントラストの高い背景を提供するために各圧子白の上部に凹部をペイントします。注意: は、時代ものの圧子押込みのリムを塗装しないでプレートとの接触。 3 D 印刷 poly(lactic acid))、またはそれ以外の場合、各ウェルにドットをする円筒形のスタンプを作製します。シリンダー トップを中心とした 5.9 mm 径、12.2 mm 円筒状突起 1.5 mm 径と高さ 1.0 mm の高を確認します。注: 3 D 印刷モデル ‘ スタンプ。STL’ 補足ファイルとして利用可能です。 プラズマ治療、プレート右-側アップ 60 の井戸でシリコーン細胞培養面をアクティブにする s、手順 2.1 で述べたように。 ゴム製のパッドやその他のソフト面にプレートを配置します。スタンプの小さな突起をプライム (手順 4.2 参照) 永久的なマーカー ペンからのインクで。テストする井戸にスタンプを挿入し、インクの良い転送を確実にタップします。すべての井戸の前にスタンプを首相します。 圧子ブロックに合わせ、傷害デバイス インデンター注油 (3.2 3.3 手順を参照)。傷害デバイスのステージ上にプレートをクランプします。傷害デバイス上にびまん性軸の明るいを配置します。 傷害デバイス上でブーム スタンドに高速カメラを設定、レンズをまっすぐ下に直面している番号の最小絞りに設定してそれを入れます。カメラに接続されているコンピューターでカメラのソフトウェアを起動します。フレーム レート ドロップ ダウン メニューで選択した 2,000 フレーム毎秒とシャッターにドロップダウン ・ メニュー選択最速露光時間高コントラスト画像が得られます。点線の井上センター。 12 井 3 x 4 グリッド ビューのフィールドを含むようにカメラを配置します。注: このフィールドのビューは、スループットと 1,280 × 1,024 イメージの解像度との間の最適な妥協点を提供しています。 ゼロ点にプレートを下げる (手順 3.2.4-3.2.6 を参照してください)。ワンクリック レコード’にトリガー’を読むことができるので、カメラのソフトウェアのボタンをクリックします。位置追跡 VI (ステップ 3.4.4) を開始します。 明るいのディフューズ軸光を入れます。3.4.6 の手順で説明されているように、プレートをインデントします。 明るい射光軸をオフにします。 カメラ制御コンピューターにインデントが発生した記録の 30-40 ms のウィンドウを見つける: カメラ ソフトウェアの高速ビデオの再生バーに開始と終了の矢印をドラッグします。保存] をクリックして、’ ファイル名 ‘ フィールドの名前を設定、’形式’ フィールドに「TIFF」を選択し、「保存」をクリックします。 目を通すのです。以上の画像を TIF ファイル (初め) を適用され、最も伸縮 (ピーク インデント) 状態。 、両方の画像でドットの幅と高さを測定するのにには、以上の画像を開き、ピーク ストレッチ サイド バイ サイド、フィジーを使用します。既定の四角形の選択ツールを使用して、クリックし、ドラッグして少なくともストレッチのイメージのドットの周りにボックスを描画します。高さと幅の単位 ‘ 分析 |メジャー ‘。 ピーク ストレッチ画像を同じよくドットの繰り返し。井戸の残りの部分に対して繰り返します。 Xおよびy方向にラグランジュのひずみを次のように計算します。注: ここでは、 Exxがx方向にラグランジュのひずみ、 Eyyがy方向にラグランジュのひずみ、 Xはドットの幅、 Yはドット、 f の高さ(すなわち、ピーク インデント画像)、最終的なイメージを示します、私は (すなわち、前のインデントのイメージ) の最初のイメージを表します。その井戸にひずみを決定する 2 つの値の平均値します。 5. めっき培養細胞 オートクレーブ箱と滅菌に使用されるバラスト重量。 プラズマ治療、シリコン底板右-側アップ 60 s (手順 2.1 を参照してください)。すぐに 15 分間 70% のエタノールを含む無菌箱の板が水没します。 30 分の個別の無菌箱に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でプレートが水没します。 井戸から PBS を吸い出しなさい。井戸がプラズマ治療を失うを防ぐために一度に 1 つのプレートを乾燥のみ。注意: シリコーン底プレート ピペッティングするとき剛板よりも少ない触覚フィードバックを提供、ピペットの先端をブロックする可能性が高い。 滅菌プレートによくあたり 0.1 mg/mL ポリ L-オルニチン (PLO) の 100 μ L を追加します。1 時間室温で孵化させなさい。 100 μ L 滅菌 PBS、細胞懸濁液の準備が整うまで、ウェルズの 2 番目の洗浄を残して二度と井戸をすすいでください。 安全手袋を使用して液体窒素貯蔵から hiPSCNs の小瓶を取り出し、ドライアイスに置きます。迅速に 37 ° C の水浴にバイアルを輸送し、まさに 3 分解凍。バイアルを旋回できません。 無菌フードで軽く 1 mL の血清ピペットを使用して 50 mL の円錐管にバイアルの内容を転送します。 部屋の温度完全なメンテナンス中 (メディア ベース + サプリメント) 1 mL で空のセラムをすすいでください。 1 秒あたり約 1 つのドロップで drop-wise 50 mL チューブにメディアの 1 mL を移します。そっと追加しながらチューブを旋回します。室温用完全培地の 8 mL を約 2 滴/秒で 50 mL のチューブに追加します。 チューブをキャップし、反転 2-3 回。診断とセルをカウントします。225,000 セル/ml に細胞懸濁液を希釈するために必要な追加のメディアの量を計算します。 (計算上) 25 mL の血清ピペットを使用して細胞懸濁液の管にメディアの量をピペット優しく。 細胞懸濁液における laminin の 10 μ G/ml を達成するために 1,000 μ L ピペットで細胞を懸濁液の 1 mL あたり 1 mg/mL ラミニン株式の 10 μ L を追加します。ラミニンの使用したチップを一度上下に吸引チューブをキャップし、一度チューブを反転します。 一度に 1 つのプレート、プレートから PBS を吸い出しなさい。マルチ チャンネル ピペットを使用して、各ウェルに hiPSCN 細胞懸濁液 100 μ L を追加します。井戸のため、面積あたりの細胞密度は 67,500 セル/cm20.33 cm2、文化エリアがあります。 添付ファイルを促進するために播種後 15 分間室温でプレートを置きます。無菌培養のフードのファン振動を避けるためには、研究室のベンチにカバー プレートを配置します。5% CO2と 37 ° C で文化を孵化させなさい。 24 時間、完全な維持媒体の 200 μ L で井戸を補充で一杯になったメディア変更を実行します。100 μ L/ウェルのメディア変更のすべての 2-3 日半を実行します。 6. 文化を毀損する行為 圧子ブロックを合わせ、3.2 で説明するように、ゼロの位置を検索します。ステップ 3.3 で説明したように、圧子押込みを塗ります。 ‘位置追跡 VI’ (ステップ 3.4.4) の変位履歴のファイル名を設定します。(ステップ 3.4.5) ‘運動制御 VI’ における損傷パラメーターを設定します。 インキュベーター外負傷し、ステージ上にクランプ プレートを取る。部屋の空気に培養をさらすことがなく、プレートを固定するための蓋の位置を調整します。 「モーション コントロール VI」を使用してゼロ点 (手順 3.2.4-3.2.6) にプレートを下げます。’位置追跡 VI’ を開始 (ステップ 3.4.4)。 (前述の手順 3.4.6 で) プレートをインデントするのに運動制御 VI を使用します。偽伸張のためのみ、このステップをスキップします。 ステージを動きの範囲の先頭に戻る (3.4.7 の手順を参照してください)。プレートをインキュベーターに戻ります。 検査し、(ステップ 3.4.8) のように変位のトレースを保存します。 7. 顕微鏡 X の染色液 2 μ G/ml ヘキスト 33342 と 5 μ G/ml 維持媒体のカルセイン AM と 10 を準備します。 それぞれを染色染色液 x 10 の 20 μ L スパイクとも。 染色 37 ° C で 15 分間インキュベートします。 幅広い分野の蛍光画像を取得します。フィルター使用従来 FITC と DAPI カルセイン AM とヘキスト 33342 信号をそれぞれイメージにセット。ウェルの画像シーケンスに 10 分以上を要する場合は、文化の健康を維持するためにステージ上のインキュベーターでプレートを囲みます。注: 10 X、0.30 NA レンズ詳細を提供十分な細胞の形態を決定するため。これが原因で多くの明るい相馬のいくつかの彩度も、神経突起の良い可視化できるように利益を調整します。 相馬と突起を識別する緑のカルセイン AM チャネルの生きているセル画像をセグメント化します。青のヘキスト 33342 チャネルで、相馬の識別を支援する核の画像を使用します。