שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן

1. סיליקון ניקוי רעלים חותכים 254 מיקרומטר עבה, 30.48 ס”מ x 30.48 ס”מ סיליקון ממברנות למלבנים 7.5 ס”מ 11 ס”מ באמצעות סכין גילוח ותבנית אקרילי. ממברנות מלבני 10 יכולה להתבצע באמצעות כל גיליון. שמור את הנייר שמגיע עם שהסיליקון. מקם את הקרומים באמבט של מים (DI) יונים עם סבון זכוכית. אחד בכל פעם, לקרצף את הקרומים נמרצות עם קצות האצבעות בכפפה לפחות 20 s או עד lathered. יש לשטוף את הקרומים תחת די מים זורמים עד הסבון lathered יוסר בעליל. שכב על הממברנות על הנייר (מתוך האריזה שלהם) וכתב autoclave על מחזור הכבידה. משרים כל קרום סיליקון ב 250 מ של 70% אתנול לכל קרום על שאכר מסלולית-סל ד 60 עבור 24 ח’ שימוש מיכל עשוי חומר אינו מגיב עם אתנול, כגון פוליפרופילן. אם אחד או יותר ממברנה ממוקם בתוך סל אחד, או אם הקרומים לדבוק בתחתית סל, להפריד את הקרומים מהסביבה שלהם עם טיפים פיפטה פלסטיק, פיפטה עצה ארונות תקשורת. להעביר את הקרומים סיליקון עם ידיים בכפפות 250 מ של מים DI לכל ממברנה ומשרים על תפקודי לב / נשימה במשך 48 שעות-60 סל ד. שכב על הממברנות בחזרה על נייר ומניחים בתנור כלי זכוכית 93 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. אחסן את הקרומים על הנייר, במקום נקי ויבש, מכוסה עוד גיליון נייר כדי להגן עליהם מפני אבק. 2. צלחת פבריקציה נוספת פלזמה מתייחסים עליון 96-ובכן צלחת עם מסך פלזמה W 200 מנקה (ראה טבלה של חומרים) 60 s על מתח גבוה, והציב אותה בצד-מלמטה בתוך הפלזמה מנקה. בדוק גם מהחלון של החדר, אשר מצביע פלזמה יעיל הקימה סגול זוהר. טכניקה זו מליטה היא ממאמרו של. Sunkara et al. 14 בתוך 60 s, מניחים צלחת העליון 200 מ של 1.5% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) במים DI למשך 20 דקות, התחתון לצד השני. פתרון זה אינו יציב: להכין אותו לא יותר מ- 60 s לפני החדרת את הצלחת.התראה: לעבוד עם APTES בשכונה fume. פלזמה לטפל של קרום סיליקון שחולצו ב הפלזמה מנקה עבור 60 s על מתח גבוה. זמן הטיפול פלזמה כך שפעולתו לא יותר מ 5 דקות לפני סוף תקופת 20 דקות בשלב 2.2. השתמש מלקחיים למיקום קרום פלזמה מטופלים מעל מלבן נייר קלף2 7.5 x 11 ס מ. ישר על 7.5 ס”מ 11 ס”מ x 0.5 ס מ לוח אלומיניום על החלק התחתון של המלחציים פבריקציה נוספת צלחת. יישר את קרום סיליקון ונייר אפייה על אלונקה אלומיניום באמצעות מלקחיים.הערה: תכנון בעזרת מחשב (CAD) עבור התקן זה ניתנים הקבצים את החומרים משלימה בתור קובץ קוד משלים ‘ העיתונות למות – 3D הגנרית. שלב ‘. החשבון המשויך של חומרים מסופק משלים טבלה 1: מותאם אישית בנה מכשירים – BOM.xlsx. להסיר את צמרות צלחת של האמבטיה APTES ומנערים את עודפי פתרון. לטבול בתוך אמבט מים 200 מ ל DI עבור 5 s ו- shake את עודף המים. לטבול בתוך אמבט מים שונים 200 מ ל DI עבור 5 s ו- shake את עודף המים. להחליף את המים האלה אמבטיות לפני טבילה נוספת צלחת העליון. להשתמש באוויר דחוס כדי העליון צלחת יבשה לחלוטין. מניחים צלחת העליון בחלק העליון של המלחציים פבריקציה נוספת צלחת. בעדינות לסגור את המלחציים פבריקציה נוספת צלחת להקיש את הלוח העליון, סיליקון ביחד. מהדק לפחות שעה. לאפשר את הצלחת לרפא עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר לפני השימוש, מוגן מפני אבק. 3. מתיחה צלחת לנקות את indenters.הערה: ראה משלים איור 1. הכן sonicator בסגנון המרחץ W 60 עם יהלו מים בטמפרטורת החדר. תמיכה הרחוב indenter מעל האמבטיה sonicator, הפוך כך רק את החלק העליון של indenters טובע עד לעומק לפחות 1 מ מ. Sonicate את indenters במשך 8 דקות ב 42 קילו-הרץ. מכה יבשה את indenters עם אוויר דחוס. יישר את הבלוק indenter. מקם מצלמה עם שידור חי מעל המכשיר מתיחה כך זה מתבונן המערך indenter. להתמקד על החלק העליון של indenters.הערה: ההגדרה המתוארות בסעיף 4, “אפיון ממברנה למתוח,” תהיה מלכודת אחת מצלמה אפשרי עבור משימה זו. לאבטח צלחת על הבמה של המכשיר פגיעה באמצעות המלחצות הבמה (איור 1) ולמקם אור כיפת על המכשיר.הערה: ראה טבלה של חומרים עבור תוכנת בקרת מכשיר. להפעיל את תוכנת בקרת מכשיר על-ידי לחיצה על סמל התוכנה על שולחן העבודה של המחשב הוא שליטה על המכשיר פציעה. להפעיל את הפרוייקט “in_vitro_neurotrauma.lvproj” על ידי לחיצה על זה בחלון השיגור. מתוך חלון project, להפעיל בקרת תנועה ומקם על כלי נגינה וירטואלי גשש “(VIs),”, אשר נקראים ‘motion_control.vi’ ‘position_tracker.vi’, בהתאמה, באמצעות לחיצה כפולה עליהם. לסגור את הכלוב סביב ההתקן פציעה. לחץ על הלחצן ‘חץ’ בפינה השמאלית העליונה של הפקד תנועה השישי כדי להפעיל את השישי ולחץ על ‘ליד למטה’ כדי להוריד את הבמה כדי בתוך 2 מ מ של פנייה ישירה של indenters. לחץ על הלחצן ‘עצור’ כדי לעצור את השישי.התראה: שמור את הידיים ברורה של האלונקה בשעת טיפול המצלמה בכלוב. הכלוב צריך להיות מצויד עם מתג הדלת מספק כוח להתקן מתיחה רק כאשר דלת הכלוב סגורה. בחלון project, קליק ימני על ‘ציר 1’. לחץ על ‘לוח הבדיקה אינטראקטיבי’. בחלון שנפתח, קבע את גודל הצעד 50 מיקרומטר על-ידי הזנת ‘500’ יחידות בשדה ‘למיקום היעד’. לחץ על הכפתור הירוק ‘לעבור’ בתחתית החלון ‘לוח הבדיקה אינטראקטיבי’ שוב ושוב עד הלוח הראשון יוצר קשר עם כל indenters. בדוק אם יש קשר על התמונה בשידור חי המוצג על-ידי המצלמה. הערה מיקום הבמה אנכי דיווחו השמאלית העליונה של חלון ‘לוח הבדיקה אינטראקטיבי’; זוהי העמדה ההתקשרות הראשונה. נמוך יותר (כפי שמתואר בשלב 3.2.6) עד כל טוב יצר קשר עם indenters. במידת הצורך, להזיז את המצלמה כדי לראות את כל הצלחת לעלות על הבמה (על-ידי ציון שלילי ‘היעד עמדה’) ולמטה. הערה מיקום הבמה אנכי דיווחו השמאלית העליונה של החלון כאשר כל ההודעות במגע (זהו המיקום קשר מלא). הערה ההבדל בין קשר ראשון לבין עמדות קשר מלא. סגור את ‘לוח הבדיקה אינטראקטיבי’. הפעל את ‘בקרת תנועה השישי”(ראה שלב 3.2.4) ולחץ על ‘למעלה’ כדי להעלות את הבמה. לעצור את בקרת תנועה השישי עם לחצן ‘עצור’. לאחר השלב בחלק העליון של הנסיעה שלו, פתח את הדלת כדי לבטל את המכשיר. התאם את הברגים קבע על הפינות של גוש indenter. לשחרר את הבורג קבע על הפינה שגרם הקשר הראשון, תנמיך והדק את הבורג השני להרים את הפינה שגרם האחרון קשר. חזור על התהליך של הנמכת הבמה עד הצלחת המגעים indenters, בוחן את התמונות קשר עבור הטיה, העלאת הבמה, ואת התאמת (שלב 3.2.9) לחסום indenter. כאשר הבמה ואת בלוק מיושרים, יגרום indenters כל קשר בעת ובעונה אחת. פתח את הדלת כדי לנטרל את המכשיר. הכנס את הברגים עניבה-מטה לתוך החורים שלהם על הבלוק indenter והדק אותם. לאשר גוש אחד עם הברגים עניבה-למטה במקום (צעדים 3.2.4-3.2.8). שימו לב מיקום הבמה שדווחו על-ידי ‘אינטראקטיבית הבדיקה החלונית’ כאשר הצלחת מבצע קשר. זה יהיה האפס לניסויים כניסה. לשמן את indenters. אם הבלוק indenter רק הוגדרה יש לא ובכל זאת כבר יכולתי, לנקות כרית גומי מוצק (7.5 ס”מ x 11 ס”מ x 1.5 מ מ), משטח גומי קצף רך, תאים סגורים (7.5 ס”מ x 11 ס”מ x 3 מ מ) עם מגבון ספוג אתנול המעבדה. לאפשר להם לאוויר יבש. להשרות מגבון מעבדת שמן תירס ולהפיץ אותה על משטח גומי מוצק לזרוח משעמם. במקום משטח קצף על גבי משטח גומי מוצק כדי להעביר שמן משטח קצף. המקום של 7.5 ס”מ 11 ס”מ x 0.5 ס מ לוח אלומיניום על גבי משטח קצף ולטעון אותו עם נטל משקל של 360 גר’ (למשל, 6 צינורות חרוט נטען עם 45 מ של מים כל) כדי להבטיח העברת עקבית של שמן מכל משטח גומי מוצק כדי לרפד את הקצף. לאפשר 10 s עבור הנפט להעביר משטח גומי מוקצף. להזיז את הפנקס פוליאוריתנים, מוצרי פוליאוריתן אל המערך indenter. מקם את לוח אלומיניום, ומשקל נטל עליו כדי להבטיח העברה עקבית של השמן עד קצות indenters. לאפשר 10 s עבור הנפט להעביר indenters. אם יש כבר מתוח אין לוחית מאז הרחוב indenter היתה להגדיר משיכור למר בפעם הראשונה, למתוח צלחת בדיקה לפני תחילת הניסוי.הערה: זה ימנע כל חוסר עקביות בין התמתחות ראשונה מותח עוקבות משתנה מתערב בניסוי. לפרקי עוקבות, חזור רק צעדים 3.3.2-3.3.5 לפני כל מתיחה. למתוח צלחת. לשמן את indenters כפי שמתואר בשלב 3.3. להבטיח את הצלחת על הבמה של המכשיר פציעה עם המלחצות הבמה. אם נדרשת עקרות, להתאים את מיקום המכסה כדי לאבטח את הצלחת מבלי לחשוף את פני התרבות לאוויר החדר. הנמך את הבמה האפס-מיקום באמצעות בקרת תנועה ‘השישי ‘ (ראה שלבים 3.2.4-3.2.6); אפס-מיקום נקבעת במהלך שלב 3.2. שנה את שם הקובץ בשדה “נתיב קובץ” ‘מקם השישי מעקב’ לשם קובץ ייחודי, ואז להפעיל אותו עם הלחצן ‘חץ’ בפינה השמאלית העליונה של החלון. הגדר את עומק ואת משך הזמן של כניסה (בדרך כלל 1-4 מ מ ו- 30 ms, בהתאמה, עומק מרבי 5 מ מ, משך מינימלי 15 ms) ‘פגיעה (מ מ)’, ‘משך הפציעה (ms)’ שדות ‘התנועה בלוח הבקרה השישי’ על-ידי לחיצה על השדות הקלדת הרצוי ערכים. להפעיל את התנועה ב’לוח בקרה’ VI’ ולחץ על ‘Injure’ כדי להסיט פנימה את הצלחת. להעביר את הבמה למעלה לחלק העליון של הנסיעה שלו על ידי לחיצה על ‘העליון’. אז תפסיק את השישי באמצעות לחצן ‘עצור’, לבטל את המכשיר פגיעה על-ידי פתיחת הדלת. בדוק את ההיסטוריה הזחה של השלב הציג את ‘מקם המעקב השישי’ כדי לאשר כי העקירה המרבי שצוין הוחל. לחץ לחיצה ימנית על הגרף ולחץ על ‘ייצוא אל Excel’. לחץ על ‘ קובץ | שמירה ‘ כדי לשמור את הנתונים. 4. אפיון מתח הממברנה צבעו את ההפסקה בחלק העליון של כל לבן indenter כדי לספק רקע חדות גבוהה עבור צילום וידאו במהירות גבוהה.התראה: לא מצייר שולי indenters שם הם לעשות קשר עם צלחות. 3D להדפיס עם poly(lactic acid) (PLA), או אחרת לפברק, חותמת גלילי עם אשר ליצור נקודה כל טוב. להפוך את הצילינדר 5.9 מ מ קוטר, גבוה, עם בליטה גלילית 1.5 מ מ קוטר, 1.0 מ מ גבוהה 12.2 מ”מ שבמרכזה העליון.הערה: דגם להדפסה תלת-ממד ‘ חותמת. STL’ זמין בתור קובץ משלים. פלזמה מתייחסים צלחת ימין בצד-להפעלת השטח התרבות התא סיליקון בבארות 60 s, כפי שהוזכר בשלב 2.1. מניחים את הצלחת על משטח גומי או משטח. פריים של בליטה קטנה על הבול (ראה שלב 4.2) עם דיו של עט טוש. הכנס את החותמת לתוך הבאר להיבדק והקש כדי להבטיח העברת טוב דיו. פריים החותמת לפני כל טוב. יישר את הבלוק indenter ולסוך את indenters של המכשיר פציעה (ראה שלבים 3.2-3.3). תהדק את הצלחת לבמה של המכשיר פציעה. הצב אור בהיר צירית לפזר מעל המכשיר פציעה. להציב מצלמה במהירות גבוהה על דוכן בום על המכשיר פציעה, פונה ישר כלפי מטה, עם העדשה מוגדר מהקטן לגדול ממוספרות עצירת f, תפעיל את זה. הפעל את תוכנת המצלמה במחשב המחובר למצלמה. מסגרת שיעור התפריט הנפתח, בחר 2,000 מסגרות לשנייה, ובשנת הצמצם הנפתחת תפריט, בחר הזמן המהיר ביותר חשיפה אשר מניב תמונות חדות גבוהה. מרכז על הבארות מנוקד. מקם את המצלמה כך בתחום התצוגה מכיל 12 בארות ברשת 3 x 4.הערה: שדה ראייה זו מציעה של פשרה אופטימלי בין התפוקה ואת הרזולוציה עבור תמונת-1280 × 1,024. הורידו את הצלחת אל נקודת-האפס (ראה שלבים 3.2.4-3.2.6). בלחיצה אחת הרשומה כפתור על תוכנת המצלמה כך שייקרא ‘הגורם המפעיל ב’. ליזום הגשש עמדה השישי (שלב 3.4.4). הפעל את ‘ מאטום לשקוף ‘ הבהיר צירית. הסט פנימה את הצלחת כפי שמתואר בשלב 3.4.6 הרעלה-הכרה. כבה האור מפוזר צירית. במחשב בקרת מצלמה, למצוא את החלון ms 30-40 של ההקלטה שבה מתרחשת לחריצים: גרור החיצים ההתחלה והסוף בבר שהווידאו במהירות גבוהה תוכנת המצלמה. לחץ על שמור, להגדיר את השם בשדה ‘שם קובץ’, בחר ‘TIFF’ בשדה ‘תבנית’, לחץ על ‘שמור’. לעבור. TIF-קבצים עבור תמונות של הפחות נמתח (מתחיל) ומתח ביותר הברית (שיא כניסה). כדי למדוד את הגובה ואת הרוחב של הנקודות ברשת גם תמונות, שימוש פיג’י לפתוח את תמונות של הפחות ואת מרב למתוח side-by-side. באמצעות הכלי בחירה מלבנית ברירת המחדל, לחץ וגרור כדי לצייר תיבה סביב נקודה בתמונה מתיחה לפחות. למדוד את הגובה ואת הרוחב עם ‘ נתח | מדידה ‘. חזור על הנקודה בבאר אותו על התמונה מתיחה שיא. חזור על שאר הבארות. לחשב את המתח לגראנז’יאן בכיוונים x ו- y כדלקמן:הערה: כאן, Exx הוא המתח לגראנז’יאן בכיוון x Eyy הוא המתח לגראנז’יאן בכיוון y , X הוא הרוחב של הנקודה, Y הוא הגובה של הנקודה, f מציין את התמונה הסופית (כלומר, התמונה כניסה שיא), אני מציין את התמונה הראשונית (כלומר, התמונה טרום כניסה). ממוצע של שני ערכים כדי לקבוע את הלחץ בתוך הבאר הזו. 5. ציפוי התאים בתרבית אוטוקלב פחי ומשקולות באלאסט שישמש עבור עיקור. פלזמה להתייחס את צלחות עם תחתית סיליקון נכון-הצד-עד 60 s (ראה שלב 2.1). מיד להטביע את הצלחות בסלי סטרילי המכיל אתנול 70% למשך 15 דקות. להטביע את הצלחות בתוך תמיסת מלח סטרילית פוספט buffered (PBS) בסלי סטרילי נפרד למשך 30 דקות. האחות של PBS מן הבארות. רק יבש לוח אחד בכל פעם כדי למנוע הבארות מאבד את הטיפול פלזמה.התראה: סיליקון צלחות bottomed לספק משוב משושי פחות מאשר צלחות קשיח כאשר pipetting, נוטים יותר לחסום את קצה פיפטה. להוסיף 100 µL של 0.1 mg/mL פולי-L-ornithine (אש ף) לכל טוב הלוחות מעוקר. דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח. יש לשטוף את בארות פעמיים עם 100 PBS עקר µL, עוזב לשטוף את השני על הבארות עד התליה תא יהיה מוכן. הסר את בקבוקון hiPSCNs אחסון בחנקן נוזלי באמצעות כפפות בטיחות ומניחים על קרח יבש. להעביר את הצנצנת כדי באמבט מים 37 ° C ובמהירות להפשיר בדיוק 3 דקות. לא מערבולת המבחנה. בשכונה סטרילי, בעדינות העברת תכולת הבקבוקון צינור חרוטי 50 מ ל באמצעות פיפטה סרולוגית של 1 מ”ל. יש לשטוף את המבחנה קריוגני ריק עם 1 מ”ל של מדיום תחזוקה מלאה בטמפרטורת החדר (בסיס המדיה + תוספת). העברה של 1 מ”ל של מדיה לתוך הצינור 50-mL drop-wise-עם טיפה אחת לשניה. מערבולת בעדינות את הצינור תוך הוספת. הוסף 8 מ של טמפרטורת החדר תחזוקה מלאה בינוני הצינור 50 מ ל- טיפות על 2/s. קאפ הצינור ואת היפוך 2 – 3 פעמים. לספור את התאים עם hemocytometer. לחשב את עוצמת הקול של התקשורת נוסף נדרש לדלל התליה תא 225,000 תאים/מ. Pipette בעדינות את כמות מדיה (החישוב לעיל) לתוך הצינור של השעיה התא באמצעות פיפטה סרולוגית 25 מ. להוסיף 10 µL של 1 מ”ג/מ”ל מניות laminin לכל 1 מ”ל של השעיה תא עם micropipette µL 1,000 כדי להשיג 10 µg/mL של laminin ההשעיה התא. תשאף פעם אחת למעלה ולמטה עם קצה המשמש עבור laminin, ואז קאפ הצינור, היפוך הצינור פעם אחת. האחות של PBS של הצלחות, לוח אחד בכל פעם. השתמש פיפטה רב-ערוצי להוסיף 100 µL של התליה תא hiPSCN כל טוב. הבארות יש אזור התרבות של 0.33 ס מ2, אז צפיפות תא שטח היא 67,500 תאים/ס מ2. לנוח הלוחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאחר זריעה כדי לקדם את הקובץ המצורף. למניעת ויברציות מאוורר של תרבות סטרילי הוד, מקם את הצלחות מקורה על הספסל מעבדה. דגירה התרבויות ב 37 ° C עם 5% CO2. לבצע שינוי לסיקור ב- 24 שעות, מילוי הבארות עם 200 µL של התקשורת תחזוקה מלאה. לבצע חצי מדיה שינוי של µL 100/טוב כל 2-3 ימים. 6. ופצעו תרבויות יישר את הבלוק indenter ולמצוא את האפס כפי שמתואר בשלב 3.2. לשמן את indenters כפי שמתואר בשלב 3.3. הגדר את שם הקובץ על ההיסטוריה הזחה ברכיב ‘עמדה המעקב השישי’ (שלב 3.4.4). להגדיר את הפרמטרים פגיעה ב- ‘בקרת תנועה השישי’ (שלב ‘ ר 3.4.5). לוקח את הצלחת להיפצע מתוך החממה ו. תהדק את זה לבמה. להתאים את המיקום של המכסה כדי לאבטח את הצלחת מבלי לחשוף את התרבויות לאוויר החדר. . תוריד את הצלחת אל נקודת האפס (צעדים 3.2.4-3.2.6) באמצעות ‘בקרת תנועה השישי’. להתחיל ‘עמדה המעקב השישי’ (שלב 3.4.4). השתמש בפקד תנועה השישי כדי להסיט פנימה את הצלחת (כפי שמתואר בשלב 3.4.6 הרעלה-הכרה). לפרקי המזויפים, לדלג על שלב זה בלבד. לחזור השלב העליון של טווח תנועה (ראה שלב 3.4.7). להחזיר את הצלחת החממה. לבדוק ולשמור את האיתור הזחה (כמו שלב 3.4.8). 7. מיקרוסקופ הכינו 10 x מכתים פתרון עם µg/mL 2 Hoechst 33342 ו-5 µg/mL Calcein AM בתקשורת תחזוקה. כתם אחד טוב עם יתד 20 µL של 10 x מכתים פתרון. תקופת דגירה של 15 דקות עם הכתם ב 37 º C. לרכוש תמונות פלורסנט שדה רחב. שימוש FITC המקובלת, דאפי לסנן קובע כדי בתמונה של Calcein AM Hoechst 33342 אותות, בהתאמה. אם הרצף הדמיה רב טוב ייקח יותר מ- 10 דקות, הקף את הצלחת ב חממה העליונה הבמה כדי לשמור על הבריאות של התרבויות.הערה: 10 X, עדשה נה 0.30 מספק מפורט מספיק לקביעת תא הכדאיות, מורפולוגיה. להתאים את הרווחים כדי להבטיח טוב החזיית neurites, אפילו אם זה גורם מסוימים רוויה של סומה הרבה בהיר יותר. קטע תמונות תא בשידור חי בערוץ Calcein AM ירוק כדי לזהות סומה neurites. להשתמש בתמונות גרעיני בערוץ Hoechst 33342 כחול כדי לסייע עם זיהוי סומא.