ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動
Summary
このプロトコルは楓生活の心内膜細胞の蛍光タンパク質の光変換の方法を記述するゼブラフィッシュ胎児房室管、心臓房室弁開発中心内膜細胞の追跡を有効にします。.
Abstract
胚発生に伴う細胞細胞行動のダイナミックな変化を受けるし、発生生物学の分野の基本的な目標は、これらの変更の背後にある細胞の論理を読み解きます。発見と蛍光タンパク質の開発が格段に動的変更の私達の理解光学的細胞や組織を強調表示する方法を提供します。ただし、光電、微速度顕微鏡観察およびそれに続く画像解析は、脳や目など臓器の細胞動態を暴くで非常に成功する証明が、このアプローチは通常使用されないため心臓の開発で心臓のサイクル中に心臓の急速な動きによってもたらされる課題。このプロトコルは、2 つの部分で構成されています。最初の部分では、photoconverting とその後中ゼブラフィッシュ房室運河 (AVC)、心臓房室弁開発心内膜細胞 (内分泌かく乱化学物質) を追跡する方法について説明します。正確な光電場所を取るために薬で心臓を一時的停止メソッドが含まれます。心は再開できる発達時間後の時点で photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングのため心臓が再び停止するまでに薬物および萌芽期の開発の除去時に鼓動が通常どおり続行されます。プロトコルの 2 番目の部分は、二次元の地図に立体構造から蛍光信号をマッピングすることにより幼胚の胚で AVC の photoconverted または非 photoconverted 領域の長さを定量化する画像解析法をについて説明します.一緒に、プロトコルの 2 つの部分は、起源とゼブラフィッシュ AVC と房室弁をし、変異体、morphants、またはと扱われている胚を研究するため適用できる可能性のある細胞の挙動を検討する 1 つをことができます。AVC および/または弁の開発を妨害する試薬です。
Introduction
ゼブラフィッシュは現在体内細胞および進化のプロセスを勉強する最も重要な脊椎動物モデルの一つです。これがゼブラフィッシュの光透過性の主因と遺伝学は、遺伝子を含む光学的手法を適用するための強力なモデルはそれにこうしてエンコード光応答性タンパク質技術1。心臓の研究に固有のゼブラフィッシュを受け取る拡散を介して十分な酸素ハートビートなしも突然変異体は発達遺伝子および摂動の影響に関する分析を許可、開発の最初の週を生き残ることができるようにほとんどの脊椎動物2で可能ではない心臓の形態形成に関する血流。
ゼブラフィッシュの心臓の管は 24 時間ポスト受精 (hpf) によって形成されます。その形成直後後心臓の管は、積極的に暴行を開始します。36 で hpf、明確な収縮心室から心房を分離します。収縮のこの地域は、立方形態3房室運河 (AVC) とこの地域の変更細胞扁平上皮の形態から呼び出されます。ゼブラフィッシュ房室弁の形態形成開始 48 時間前後は、受精を投稿します。5 日ポスト受精、2 つの弁尖は、AVC に拡張し、4心周期の間に、心室から心房への血液の逆流を防ぐ。AVC と弁形成過程における細胞の追跡を介して伝統的なタイムラプス顕微鏡5,6セルに従うことが困難な心の急速な打撃としては困難です。このプロトコルは、スティードら2016年7から適応で楓の蛍光蛋白質の表現に使用されるなTg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)8ゼブラフィッシュ遺伝子組換え回線を使用する方法を記述します。血管内皮細胞は、心内膜を含みます。36 55 の hpf と発生時間の特定ポイントで photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングの内分泌かく乱化学物質の正確な光電に暴行、心臓を一時的に停止、薬 2, 3-butanedione-2-ジアセチルモノオキシム (BDM) が使用されます。以前、内分泌かく乱化学物質 photoconverted このメソッドを使用してが変換されていない近所の人たちと区別することができますまま光電7時間後 5 日間以上に示されています。このプロトコル 48 より若い胚における内分泌かく乱化学物質 photoconverted の画像解析に使用するメソッドの詳細も hpf は、AVC 開発 (Boselliらプレスで)9中に組織の動きに従う正常に使用されています。我々 は、読者がこのプロトコルを有用見つける AVC とバルブの開発、正常な胚、変異体、morphants、または薬剤を投与した胚を研究するため願っています。ゼブラフィッシュの開発中に蛍光タンパク質を用いた細胞追跡に関連する一般的なプロトコル、ロンバルドら、2012年10投稿記事をご覧ください。
Protocol
Representative Results
Discussion
光電のタイミング: 96 でも内分泌かく乱化学物質の鮮やかな表現が楓のまま hpf、胚が大きくなると、レーザー光を拡散させるより楓の限られた光電をより困難になり、AVC に達する前にそれに注意してください。At 萌芽期段階の 55 以降 hpf、心室と心房のバルーニングもの光電用バイオレット レーザー ビームが心房または心室のどちらかを最初の通過せず AVC 細胞を達することができな…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 はこのプロトコルで記述されている金型を助けるためバジーレ Gurchenkov ナタリー Faggianelli、デニス · Duchemin アン ロール Duchemin を感謝したいです。この作品は FRM (DEQ20140329553)、(ANR-15-CE13-0015-01、ANR-12-ISV2-0001-01) ANR、エンボ若い調査官プログラム ERC CoG N ° 682938 欧州共同体によってサポートされない Evalve ・ グラント ANR-10-LABX-0030-INRT、フランスの州の資金管理ANR-10-アイデックス-0002-02 というラベルの付いたフレーム プログラム Investissements d’Avenir の下のアジャンス ナシオナル デ ラ凝った。
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
Riferimenti
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