Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen
Summary
Diese Mitteilung beschreibt Methoden zur Isolierung und Kultur der alveolären Makrophagen aus Menschen und murinen Modellen zu Versuchszwecken.
Abstract
Alveoläre Makrophagen sind unheilbar differenzierte, Lunge-Bewohner Makrophagen pränatalen Ursprungs. Alveoläre Makrophagen sind einzigartig in ihrem langen Leben und ihre wichtige Rolle bei der Lungenentwicklung und Funktion sowie ihre Lunge lokalisiert Reaktionen auf Infektionen und Entzündungen. Bisher existiert kein einheitliches Verfahren für die Identifizierung, Isolierung und Handhabung der alveolären Makrophagen von Menschen und Mäusen. Diese Methode ist für Studien über diese wichtigeren angeborenen immunen Zellen in verschiedene experimentelle Einstellungen erforderlich. Die hier beschriebene Methode, die leicht von jedem Labor übernommen werden können, ist ein vereinfachter Ansatz Ernte alveoläre Makrophagen aus alvéolaire Lavage Fluid oder von Lungengewebe und pflegen sie in Vitro. Da alveoläre Makrophagen in erster Linie als adhärente Zellen in den Alveolen auftreten, liegt der Schwerpunkt dieser Methode auf verdrängen sie vor der Ernte und Identifikation. Die Lunge ist ein stark vaskularisierte Organ, und verschiedene Zelltypen myeloischen und lymphatischen Ursprungs bewohnen, interagieren und durch die Lunge Mikroumgebung beeinflusst werden. Mit dem Satz von oberflächenmarker beschrieben hier, können Forscher leicht und eindeutig andere Leukozyten alveoläre Makrophagen unterscheiden und für downstream-Anwendungen reinigen. Die Kultur-Methode entwickelt hierin unterstützt sowohl menschlich als auch Maus alveoläre Makrophagen für in-vitro- Wachstum und ist kompatibel mit zellulären und molekularen Studien.
Introduction
Die Lunge Mikroumgebung ist ein einzigartig Komplexes Ökosystem mit einer aufwendigen Luftleitung und Gefäßsystem. Die eingeatmete Luft geht durch die Luftröhre und durch zahlreiche Zweige der Bronchien und Bronchiolen vor Erreichen der Alveolen, wo die Blut-Luft-Gasaustausch auftritt. Durch direkte Interaktion mit der Atmosphäre erfordert die respiratorische Oberfläche Schutz vor potenziell schädlichen Auswirkungen von luftgetragenen Partikeln und Schadstoffen. Eine Reihe von physikalischen, chemischen und immunologischen Barrieren schützen die Lungen. Bereitstellung von Phagozyten an der respiratorischen Oberfläche dient vor allem eine wichtige Erstlinien Abwehrsystem. Alveoläre Makrophagen (AMs) sind eine Art von Lungenkrebs-Resident Phagozyten, und sie bilden die überwiegende Mehrheit der Lunge Makrophagen Pool. Wie ihr Name schon sagt, AMs sind in erster Linie auf das alveoläre Lumen lokalisiert und treten als festsitzende Zellen, die ständig der Umgebungsatmosphäre zu probieren und die Kommunikation mit der alveoläre Epithel1. Im Steady-State Lunge sind mehr als 95 % der Phagozyten im alveolären Bereich AMs2, deren Zusammensetzung aufgrund von Entzündungen, Infektionen oder chronische Exposition gegenüber Schadstoffen verändern kann.
AMs beteiligen sich eine Vielzahl von Funktionen, die möglicherweise lokal auf die Lunge und/oder systemrelevant. AMs sind beispielsweise wichtig bei der Entwicklung und die optimale Funktion der Lunge; immunüberwachung; und Freigabe der zelltrümmer, eindringende Krankheitserreger und inhalierten Partikel3,4,5,6,7. Gezielte Dezimierung der AMs ist bekannt, Räumung von respiratorischen Viren und Bakterien4,8beeinträchtigen. Neben ihrer Rolle als Phagozyten und eine Erstlinien Verteidiger der pulmonalen Homöostase, AMs sind dafür bekannt, funktionieren wie Antigen-präsentierenden Zellen in entlocken T Zell-Immunität9, die Wirksamkeit der intranasale Impfstoff10 potenzierende und Beeinflussung der Lunge eingeschränkt Autoimmunität nach Lung Transplantation11,12. Mangel AM Funktion ist verbunden worden, um pulmonale alveoläre Proteinosis (PAP), eine Bedingung, die durch eine genetische Mutation, Bösartigkeit oder Infektion, die Clearance von pulmonalen Tenside13,14beeinträchtigt. Transplantation von AMs wird jetzt als einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung von PAP- 15,16geprüft.
AMs sind bekannt in der Embryogenese stammen und in den Lungen lebenslang beibehalten, ohne durch zirkulierenden Leukozyten2,17ersetzt. Obwohl AM Umsatz in homöostatische Lunge nicht nachweisbar ist, sind unterschiedlicher AM Umsatz in bestimmten klinischen Bedingungen, einschließlich Infektion berichtet worden, durch das Influenza-Virus4, Bolusinjektion Bestrahlung18, Einwirkung von endotoxin 19und Alter20. AMs werden geglaubt, um über eine minderwertige Verbreitung17,21selbst zu erneuern, aber einige neuen Studien behaupten, dass Monozyten können Anlass zu einer Bevölkerung von intravaskulären Lunge Makrophagen22,23 unter experimentelle Bedingungen, aber Funktionalität diese neu konvertierte pulmonaler Makrophagen haben noch bei Lungenkrankheiten definiert werden. Darüber hinaus ist die verstehen der Schwellenwerts des Reizes im Zusammenhang mit der Aktivierung AM eine potenziell interessante Gegend, wie die Lunge ein Gleichgewicht zwischen den entzündlichen Signalen und immunregulatorische Maschinen zu bewahren versucht.
Die physiologischen oder pathologischen Veränderungen, die zu Verlust der Immunregulation sind wichtig, in verschiedenen klinischen Einstellungen (z. B. Infektionen der Atemwege, entzündliche Lungenerkrankungen und fibrotische Lungenerkrankung) zu bewerten. AMs werden allerdings zunehmend als Indikatoren oder sogar Determinanten der pulmonalen Gesundheit11,24anerkannt. Derzeit gibt es keine einheitliche Protokolle zur Ernte, Charakterisierung und/oder Aufrechterhaltung AMs aus Mensch und präklinischen murinen Modellen. Mangel an Konsens über AM Ausgangsstoffe und Phänotypen und fehlender eine detaillierte Methode das Haupthindernis in Entzifferung Rolle(n) AM pulmonalen Gesundheit und Krankheit gewesen. Das folgende Protokoll bietet ein endgültiges Identifikations-, isoliert und in-vitro- Kultur-Strategie, die stark AM gezielte diagnostische und therapeutische Studien erleichtern und das Verständnis der AM Verhalten wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
AMs sind langlebige Lunge ansässige Makrophagen, die die Lunge beginnt bei der Geburt und dauerhaft über die gesamte Lebensdauer26bevölkern. Ihre Rollen in pulmonalen Physiologie7 und Pathologie12 und ihr Potenzial zur pulmonalen Autoimmunität24 Vorhersagen wurden erkannt. Da AMs eine langfristige Präsenz in der Lunge11,27 haben und Aktivierung und Fortschreiten d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts Clare Prendergast. Sicherheitsanweisungen wird unterstützt durch eine Forschung gewähren (#2095) von der Stiftung Flinn und TM wird unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01HL056643 und R01HL092514). Sicherheitsanweisungen der Methoden entwickelt, die Studie konzipiert und schrieb das Manuskript; OM mit Tierversuchen und klinischen Probe Beschaffung unterstützt; SB mit durchflusszytometrischen Analyse und Zellsortierung unterstützt; TM die Studien überwacht und überprüft das Manuskript.
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
Riferimenti
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