Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines
Summary
Cette communication décrit les méthodes d’isolement et culture des macrophages alvéolaires, des humains et des modèles murins à des fins expérimentales.
Abstract
Les macrophages alvéolaires sont des macrophages différenciés en phase terminale, poumon-résident d’origine prénatale. Les macrophages alvéolaires sont uniques dans leur longévité et leur rôle important dans le développement pulmonaire et la fonction, ainsi que leurs réponses pulmonaire localisée à l’infection et l’inflammation. A ce jour, n’existe aucune méthode unifiée pour identification, isolement et manipulation des macrophages alvéolaires chez l’homme et de la souris. Une telle méthode est nécessaire pour les études sur ces cellules immunitaires innées importants dans divers contextes expérimentaux. La méthode décrite ici, qui peut être facilement adoptée par n’importe quel laboratoire, est une approche simplifiée pour la récolte des macrophages alvéolaires de lavage bronchoalvéolaire ou de tissu pulmonaire et leur maintien in vitro. Parce que les macrophages alvéolaires se produisent principalement comme des cellules adhérentes dans les alvéoles, cette méthode porte sur les déloger avant la récolte et l’identification. Le poumon est un organe très vascularisé, et divers types de cellules d’origine myéloïde et lymphoïde habitent, d’interagissent et sont influencés par le microenvironnement de poumon. En utilisant l’ensemble des marqueurs de surface décrit ici, chercheurs peuvent facilement et de manière univoque distinguer les macrophages alvéolaires d’autres leucocytes et les purifier pour applications en aval. La méthode de culture élaborée dans cet article prend en charge les deux homme et macrophages alvéolaires pour la croissance in vitro de la souris est compatible avec les études cellulaires et moléculaires.
Introduction
Le microenvironnement pulmonaire est un écosystème complexe unique avec un conduit d’air élaborée et le système vasculaire. L’air inhalé se déplace à travers la trachée et à travers de nombreuses branches des bronches et des bronchioles avant d’atteindre les alvéoles, où l’échange de gaz du sang-air se produit. En raison d’une interaction directe avec l’atmosphère, la surface respiratoire requiert une protection contre les effets potentiellement nocifs de polluants et de particules en suspension dans. Un certain nombre de barrières physiques, chimiques et immunologiques protéger les poumons. Notamment, le déploiement des phagocytes à la surface respiratoire sert un système de défense de première ligne importante. Les macrophages alvéolaires (AMs) sont un type de phagocytes poumon-résident, et ils représentent la grande majorité de la piscine de macrophages pulmonaires. Comme leur nom l’indique, AMs sont principalement localisés dans la lumière alvéolaire et se produisent comme des cellules sessiles qui constamment goûter l’atmosphère ambiante et de communiquent avec l’ épithélium alvéolaire1. Dans les poumons de l’état d’équilibre, plus de 95 % des phagocytes dans l’espace alvéolaire sont AMs2, dont la composition peut changer en raison d’une inflammation, une infection ou une exposition chronique aux polluants.
AMs participent à un large éventail de fonctions qui peuvent être locales vers les poumons et/ou d’importance systémique. Par exemple, AMs sont essentiels dans le développement et le fonctionnement optimal des poumons ; surveillance du système immunitaire ; et l’enlèvement des débris cellulaires, invasion de pathogènes et les particules inhalées3,4,5,6,7. Déplétion ciblée d’AMs est connue pour nuire apurement des virus respiratoires et bactéries4,8. Outre leur rôle de phagocytes et une première ligne de défenseurs de l’homéostasie pulmonaire, AMs sont connus pour fonctionner comme des cellules présentatrices d’antigène en incitant T cell immunité9, potentialiser l’efficacité du vaccin intranasal10 et qui influent sur l’auto-immunité restriction pulmonaire après transplantation de poumon11,12. Carence en fonction de l’AM a été liée à la protéinose alvéolaire pulmonaire (PAP), une condition résultant d’une mutation génétique, une tumeur maligne ou une infection qui altère le dégagement de surfactants pulmonaires13,14. Transplantation d’AMs est maintenant à l’étude comme une approche thérapeutique pour le traitement du PAP 15,16.
AMs sont connus sont créés au cours de l’embryogenèse et persister dans les poumons tout au long de la vie sans être remplacé par circulant leucocytes2,17. Bien que le chiffre d’affaires AM est indétectable dans les poumons homéostatiques, différents niveaux de chiffre d’affaires de AM ont été signalés dans certaines conditions cliniques, y compris l’infection influenza virus4, myéloablatif irradiation18, exposition d’endotoxine 19et20de la vieillesse. AMs sont censés se renouveler par une prolifération de bas grade17,21, mais des études récentes affirment que les monocytes peuvent donner lieu à une population d’intravasculaire pulmonaire macrophages22,23 sous les conditions expérimentales, mais les fonctionnalités de ces macrophages pulmonaires nouvellement convertis doivent encore être définis dans les maladies pulmonaires. En outre, comprendre le seuil de stimulation dans le contexte d’activation AM est un potentiellement intéressant, car le poumon tente de préserver un équilibre entre les signaux inflammatoires et la machinerie immunorégulatrices.
Les altérations physiologiques ou pathologiques qui mènent à la perte de la régulation immunitaire sont importantes pour évaluer dans divers contextes cliniques (p. ex., les infections respiratoires, la pneumopathie inflammatoire et fibreuse de la pneumopathie). Néanmoins, AMs sont plus en plus reconnues comme indicateurs ou même déterminants de la santé pulmonaire11,24. Actuellement, il n’existe aucun protocole unifié pour la récolte, qui caractérisent, et/ou maintien AMs chez l’homme et des modèles murins précliniques. Absence de consensus sur les phénotypes et les précurseurs de l’AM et l’absence d’une méthodologie détaillée avaient été l’obstacle majeur à déchiffrer les rôles d’AM dans la maladie et la santé pulmonaire. Le protocole suivant propose une identification définitive, isolement et in vitro culture stratégie qui sera grandement avancer la compréhension du comportement de l’AM et faciliter les études diagnostiques et thérapeutiques ciblées AM.
Protocol
Representative Results
Discussion
AMs sont des macrophages pulmonaires-résident de longue durée de vie qui peuplent les poumons commence à la naissance et qui persiste au cours de la durée de vie entière26. Leur rôle dans la physiologie pulmonaire7 et pathologie12 et leur capacité à prédire d’auto-immunité pulmonaire24 ont été reconnus. Parce qu’AMs ont une présence à long terme dans les poumons11,<sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Clare Prendergast d’assistance avec l’édition du manuscrit. DKN est pris en charge par une recherche concession (#2095) de la Fondation Flinn et TM est pris en charge par des subventions du National Institutes of Health (R01HL056643 et R01HL092514). DKN mis au point des méthodes, destiné à l’étude et a écrit le manuscrit ; OM a aidé avec les études chez l’animal et l’approvisionnement de l’échantillon clinique ; SB a contribué à l’analyse en cytométrie en flux et tri de cellules ; TM a supervisé les études et ont examiné le manuscrit.
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
Riferimenti
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
