マウス顎下腺唾液腺の直立した生体顕微鏡検査のための準備
Summary
手術を公開し、直立した生体顕微鏡を用いた生体イメージングのマウス顎下腺唾液腺を安定させるためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、頭部および頸部マウスの他の小さい齧歯動物の他の外分泌腺に容易に適応です。
Abstract
顎下腺の唾液腺 (SMG) は、生物学的研究、細胞生物学、腫瘍学、歯科学、免疫学などの様々 な分野の関心の 3 つの大唾液腺の一つです。SMG は外分泌腺の分泌の上皮細胞、芽、血管内皮細胞、神経、細胞外マトリックスで構成されています。ラット、マウス SMG の動的な細胞プロセス イメージが以前作成された、逆多光子顕微鏡システムを用いた主。ここでは、直立した多光子顕微鏡システムを生体内イメージングのための麻酔下のマウスのマウスの SMG の安定化と手術の準備のための簡単なプロトコルについて述べる。我々 は内因性の代表的な生体画像セットを提示し、に対して転送蛍光細胞、血管や唾液管フィブリル型コラーゲンを視覚化する第 2 高調波発生のラベルを含みます。合計では、私達のプロトコルは生体イメージング免疫学の分野でよく使用される正立顕微鏡システムでマウス唾液腺の手術準備のためことができます。
Introduction
唾液は消化酵素として抗菌物質1,2を提供する食品を注油、口腔管の粘膜の表面を保護する外分泌腺から分泌されます。口腔粘膜に散在の小唾液腺、に加えて、位置1,2によると主要な腺、舌下腺, 顎下腺, 耳下腺, として識別の 3 つの両側セットがあります。ピラミッド状の上皮細胞がフラスコ状嚢 (腺) に編成または筋上皮細胞と基底膜に囲まれた demilunes 唾1の漿液性と粘液の成分を分泌します。彼らは最終的に単一の排泄ダクト1に参加するまで横紋筋性ダクトに結合する介在部に腺下水管の狭い内腔領域。SMG の主排泄管ウォートンのダクト (WD) と舌下涙丘3,4に表示されます。SMG 上皮区画は、したがって、マニホールド ターミナル エンドポイント、ブドウ1,5,6のバンドルに似た高い葉状構造を表します。SMG 間質は、副交感神経神経8と細胞外マトリックス5を含む結合組織7に埋め込まれた血液やリンパ容器で構成されます。通常の人間と齧歯動物の唾液腺には、T 細胞、マクロファージ、樹状細胞9と同様、免疫グロブリンを分泌する形質細胞 (伊賀) 唾9,10にも含まれます。健康と病気、その多面的な機能のため、SMG は生物学的研究、細胞生物学、生理学8、腫瘍12免疫11歯科4などの多くの分野の関心の対象3。
細胞の動的過程と相互作用のイメージングは、生物学研究13,14の強力なツールです。複雑な組織13 の細胞プロセスを直接調べるの深部組織イメージングと革新的な inmicroscopes 非線形光学 (固定) に基づく、散乱またはサンプルによって複数の光子の吸収を利用する開発ができました、15。複数の光子の吸収低エネルギー光子、焦点面にどの範囲蛍光励起によって合計励起エネルギーの配信を含みより深い組織浸透還元生成やフォーカスの外からのノイズをできるように励起13,15。この原則は 2 光子励起顕微鏡 (14) で採用されている、まで 1 mm15,16の深さにおける蛍光試料のイメージングできます。市販 14 ユーザーフレンドリーかつ信頼性の高い設定となっている、生体イメージングのための主要な挑戦は慎重に公開し、イメージング時系列経過のため特に麻酔下マウスの臓器を安定させます。デジタル ドリフト補正データ集録後のいくつかのメソッド公開17,18と我々 は最近”VivoFollow”、リアルタイムを使用して遅い組織ドリフトを打ち消す自動補正システムを開発、コンピューター化されたステージ19。ただし、まだ高画質化組織運動、呼吸や鼓動19によって引き起こされる特に高速な動きを最小限に抑えるために重要です。準備および安定化の手順は、脊髄20、肝21、皮膚22、23肺リンパ節24など、複数の臓器に発行されています。さらに、ラット唾液腺イメージングのためのモデル開発3,25をされているし、さらに洗練された高解像度 SMG に合わせて、倒立顕微鏡セットアップ26,マウスの生体イメージング27,28。
ここでは、免疫学の分野で生体イメージングに用いられる直立非線形顕微鏡を用いたしてマウス SMG の生体イメージングのための実用的かつ適応プロトコルを提示します。このため、膝窩リンパ節の準備に使用される広く使用されている固定ステージを変更しました。
Protocol
すべての動物の仕事を動物実験のための州委員会によって承認されており、連邦政府のガイドラインに従って実施します。 1. マウスを麻酔します。 白衣、手袋など保護具を着用します。 ケタミン、キシラジンと作業濃度 20 mg/mL と 1 mg/mL の生理食塩水をそれぞれ混ぜます。在庫を腹腔内注入 (i. p.) 8-10 μ L/マウスの g で。ケージに戻るには、マウスを置き?…
Representative Results
このプロトコルでは、ほぼ全体背や腹側の SMG の画像をことができます。また、ビューのフィールドには、細胞構成4の SMG とは少し異なります舌下腺の唾液腺も含まれています。両方の腺はフィブリル型コラーゲンによってカプセル化され、葉に細分されます。ほとんど 14 システム 2nd高調波信号を測定することによってフィブリル型コラー?…
Discussion
このプロトコルでは、免疫学の分野でよく使用されます直立の非線型顕微鏡を用いたマウスの顎下腺と舌下腺唾液腺の生体内イメージングのための簡単な方法を提供しています。メソッドは、頭頸部領域の他の外分泌腺のイメージングのために合わせることができます。例えば、私たちの研究室は (図示せず) 類似している方法で、涙腺のイメージングを実行しています。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、スイス国立財団 (SNF) プロジェクト助成金 31003A_135649、31003A_153457 と (合弁会社) に 31003A_172994 とレオポルジナ親睦 LPDS 2011-16 (BS) の資金を供給されました。この作業を「顕微鏡イメージング センター」(MIC) ベルン大学光セットアップから恩恵を受けて。
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
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Citazione di questo articolo
Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).