בסיוע פורמלדהיד בידוד של אלמנטים הרגולציה על אמצעי נגישות כרומטין בתאים בתרבית

1. יום 1: תרבית תאים התרבות התאים כדי להיות ניתח את הכמות הרצויה. תא תרבות ותנאים מדיה תלויים סוגי תאים תחת חקירה.הערה: באופן עקרוני, כל התאים האיקריוטים היא לבצע ניתוח של כרומטין נגישות על ידי שלהם. עבור ניסוי זה, 4 x 106 HEK-293T תאים הם נזרע בקערה אחת 10 ס מ בינוני DMEM בתוספת 10% (v/v) FBS ו 1% (w/v) פניצילין/סטרפטומיצין, מודגרות ב 5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה עד התאים מגיעים למפגש 70-80% (~ 8 x 10 6 תאים לכל מנה). 2. יום 2: Crosslinking פורמלדהיד, קציר תאים התראה: פורמלדהיד הוא רעיל מאוד ויש להשתמש תמיד תחת ברדס fume. ללבוש בגדי הגנה (כפפות, חלוק המעבדה). להשליך את הפסולת כראוי. הוסף פורמלדהיד ישירות אל המדיום תרבות תא בשכונה fume להגיע ריכוז סופי של 1% (v/v) (270 µL של 37% (v/v) פורמלדהיד עד 10 מ”ל של התא תרבות בינוני). תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר (20-25 ° C), השמדת לוחיות הרישוי באופן ידני כל 2 דקות.הערה: הזמן crosslinking ניתן להתאים בהתאם לסוג התא. עבור הרוב המכריע של שורות תאים, 10 דקות של crosslinking מספיקה. בשביל לרקמות, incubations יותר זמן יידרש כדי לאפשר את הקיבעון של כל התאים. להוסיף גליצין ריכוז סופי של 0.125 מ’ כדי להרוות את הפורמלדהיד (להוסיף 500 µL מניה גליצין 2.5 מטר 10 מ”ל של תרבות בינוני). תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, השמדת כל 2 דקות. לשטוף את התאים 3 x עם PBS קר קרח (8 g/L NaCl, 0.2 g/L אשלגן כלורי, 1.44 g/L נה2HPO4 · 2 H2O, 0.24 g/L ח’2PO4, להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl או NaOH). האחות המדיום ולשטוף ישירות בתיבה תא תרבות מאכל או את הבקבוק על-ידי הוספת 10 מ”ל ל- PBS. חזור על שלב זה פעמיים נזהרים מאוד במקרה של תאים באופן רופף חסיד כגון HEK-293T. הוסף PBS בקפידה לצד המנה על מנת למנוע ניתוק של התאים. לאחר לשטוף את השלישי, resuspend התא 1 מ”ל של PBS קר קרח, העברת צינור התגובה 1.5 mL על קרח. להשתמש במגרדת התא כדי לנתק את התאים בעת הצורך.הערה: כאשר החל חומר מוגבל, השתמש צינורות DNA מחייב נמוך כדי למנוע אובדן מדגם במהלך ההליך. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g x 300 ב 4 ° C ומפרידה שולחן מקורר. למחוק את תגובת שיקוע על ידי בקפידה כ רפה בעברית. 3. תא פירוק ושברים כרומטין Resuspend בגדר תא 1 מ”ל מאגר של פירוק שלהם (1% (w/v), 10 מ מ EDTA, 50 מ מ טריס HCl pH 8.1, 10 µg/mL leupeptin, aprotinin µg/mL 10, 2 מ מ PMSF), resuspend את התאים על ידי בקפידה pipetting לאורך מספר פעמים. תקופת דגירה של 20 דקות על קרח. אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס בשלב זה אם יש צורך. Sonicate תפור את הדנ א כדי להטות אותה לגודל הממוצע של 200-300 bp. הגדרות ספציפיות של sonicator צריכה להיקבע עבור כל מקור של המכשיר בשימוש sonication ודוגמאות. בכל מקרה, ודא כי ה-DNA ביעילות לכסנתם. שלב אופטימיזציה עבור הגז דנ א מתוארת תחת שלב 5.14. מגניב הדגימות על קרח במהלך sonication כדי למנוע חימום של המדגם. Centrifuge לדוגמה עבור 15 דקות ו- g x 13,000 ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע צינור התגובה. לפצל את הדגימות ב 100 µL aliquots. אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס, במידת הצורך.הערה: הפרוטוקול יכול להיות מופרע בשלב זה. 4. דה-crosslinking של פקד ה-DNA קח µL 100 aliquot מהשלב 3.4 כדי להפוך את crosslink וכדי לשמש כהפניה DNA הכולל. להוסיף 10 µL של RNase-A (10 mg/mL), תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. להוסיף 10 µL של Proteinase K (20 מ”ג/מ”ל). להשתמש התרמו-בלוק לתכנות דגירה במשך 4 שעות ב 37 ° C ולאחר מכן עבור 6-אייץ ‘ ב 65 ° C כדי לבקע את החלבונים וכדי להפוך את crosslinks. לבסוף, החזק את הדגימות ב 4 ° C עד הפרוטוקול הוא חידש ולאחר מכן המשך לשלב 5.הערה: פרוטוקולים אחרים שלהם להשתמש כרומטין דגימות מתאי אשר לא היה תפור כהפניה, ובכך המבטלת את הצורך דה-crosslinking11. העובדה כי הדוגמיות הללו אינם תפור עלול להוביל הבדלים את היעילות sonication או ב- DNA יציבות, לכן השימוש הכולל דוגמיות דנ א אשר עברו את אותו הנוהל כמו הבדיקה דוגמאות הוא מדויק יותר. 5. יום 3: טיהור פנול: כלורופורם של דנ א קח את הלא-דה-תפור aliquot מהשלב 3.4. להוסיף 10 µL של RNase-A (10 mg/mL), תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. קח את הצעד הלא-דה-תפור טופס aliquot 5.1 המדגם דה-תפור מ שלב 4.2 והמשך במקביל. הוסף H2O להגיע נפח סופי של 300 µL. הוסף µL 300 באלכוהול פנול: כלורופורם: isoamyl (25:24:1) fume הוד ו מערבולת נמרצות.התראה: פנול הוא מאכל רעילים ויש להשתמש תמיד תחת ברדס fume. בגדי מגן (כפפות, חלוק המעבדה), ודא הצינורות התגובה סגורות בחוזקה, להשליך את הפסולת כראוי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס. להעביר בזהירות µL 280 מימית השלב העליון צינור התגובה. ודא כי לא לקחת שום פסולת לאטמוספרה אשר מכילה גם חלבונים. למחוק את השלב התחתון הנותרים כפסולת בממיסים אורגניים. חזור על שלבים 5.3 עד 5.5 ולהעביר בזהירות µL 270 מימית השלב העליון צינור התגובה. הוסף µL 270 של כלורופורם fume הוד ו מערבולת נמרצות.הערה: שלב זה משמש כדי לחסל את כל פנול הנותרים מדגם. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס. בזהירות העברה µL 250 מימית השלב העליון צינור התגובה, מטפל לא לשאת כל פסולת לאטמוספרה. למחוק את הדגימה הנותרים כפסולת בממיסים אורגניים. הוסף µL 25 של 5 M NaCl 250 µL של אלכוהול איזופרופיל. להוסיף 5 µL של גליקוגן (20 מ”ג/מ”ל) כנשא הדנ א. לערבב היטב על ידי היפוך הצינורות, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, כדי לזרז את ה-DNA. לשטוף את צניפה DNA עם 400 µL של 70% (v/v) אתנול. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס. וארוקן את תגובת שיקוע בזהירות ולתת בגדר יבש למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend במאגר 100 µL TE (10 מ מ טריס pH 8, 1 מ”מ EDTA). דגירה הלא-דה-תפור חינם לדנ במשך 4 שעות ב 65 ° C כדי להסיר את crosslinks בין ה-DNA. לאחסן את הדגימות ב-20 ° C. לכמת את כמות הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים ולהפעיל את aliquot כדי לבדוק את גודל המקטע על ג’ל agarose 2% (w/v). כוונן את ההטיה והזמן עוצמות, בהתאם לתוצאות הניתוח גודל ה-DNA על-ידי agarose של ג’ל אלקטרופורזה, כדי להשיג את גודל ממוצע של 200-300 bp. 6. קביעת חינם לעומת, סה כ- DNA על ידי בזמן אמת כמותיים PCR (לרביעיית-PCR) היחס של DNA ללא נוקלאוזום (בחלק זה המכונה דנ א חינם) לעומת סך הדנ א נקבע על-ידי לרביעיית-PCR17,18. דוגמאות יכול גם להיות באופן כמותי נותחו על ידי הכלאה microarray או רצף עמוק עבור האישושים הגנום כולו. עיצוב תחל qPCR עבור האזורים להיבדק ועבור הפקדים חיוביים ושליליים.הערה: מתאים חיובי הבקרות תחל ממוקם האמרגן של משק פעיל משועתקים גנים כגון ACTB, GAPDH, TPI1 או TUBA1A (קידוד β-אקטין, GAPDH, TPI או α-טובולין). הפקדים המתאימים שליליים מצויים אזורים הטרוכרומטין או מדבריות גנים. פקדים אחרים שלילי מתאים ניתן לעצב גנומית אזורים סמוכים לוקוס מוסדר באופן דינמי תחת חקירה לפקד עבור העותק המקומי מספר הבדלים (טבלה 1). לדלל דגימות ה-DNA כדי ריכוז סופי של 10 ng/µL עם מאגר טה, ולקחת בחשבון לצורך חישובים סופית הגורם דילול (ראה שלב 6.5). להגדיר את תגובה qPCR triplicates בצלחת 96-ובכן, עם המיקס התגובה הבאה לאדם טוב: תבנית ה-DNA: 20 ng (2 µL), פריימר לפנים 200 ננומטר (0.4 µL מניה 5 מיקרומטר), פריימר הפוכה 200 ננומטר (0.4 µL מניה 5 מיקרומטר) , מוכן מסחרי השימוש תערובת התגובה המכיל צבע ירוק (5 µL מניה 2 x), ו- H2O כדי 10 µL. להפעיל את התקן qPCR בזמן אמת, באמצעות מצב כימות מוחלטת, וקבע ה-Ct של הדגימות עם זוגות שונים פריימר. לחשב את היחס של התאוששות של DNA חינם ל- DNA הכולל עבור כל פריימר באמצעות הנוסחה הבאה, לוקח בחשבון את הגורמים לדילול מהשלב 6.3:התוצאות נציג, חישוב דוגמה מקבלים בטבלה מס ‘ 2. כדי לפצות על ההבדלים בין דגימות, לנרמל של היחס שחזור בקרה חיובית: