Varisler oluşumu ve kurtarma merkezi nöron aksonlar içinde çalışmak için bir Microbiomechanical sistemi
Summary
Bu iletişim kuralı bir fizyolojik alakalı, basınçlı sıvı yaklaşım varicosities nöronlar içinde hızlı ve geri dönüşümlü indüksiyon için açıklar.
Abstract
Aksonal varicosities akson heterojenite yüksek derecesi ile Miller boyunca genişlemiş yapılardır. Onlar sadece beyin nörodejeneratif hastalıklar veya yaralanma ile ama aynı zamanda normal beyin bulunur. Burada, biz varisler oluşumu ve türdeş olmayan protein kompozisyon yöneten mekanizmalarını anlamamızı sağlayan hızlı, güvenilir ve ters aksonal varicosities, ikna etmek için bir yeni kurulan micromechanical sistemi açıklanmaktadır. Bu sistem farklı hücre altı bölmeleri nöronların, esas olarak germe etkisi üzerinde odaklanmak diğer vitro sistemlerinden farklı sıkıştırma ve kayma stres etkilerini değerlendirmek için bir roman araç temsil eder. Önemlisi, bizim sistemi ve benzersiz özellikleri sayesinde, son zamanlarda basınçlı sıvı uygulama hızla ve geri dönülebilir olarak geçici reseptör potansiyeli kanal etkinleştirmesi üzerinden aksonal varicosities tetikleyebilir gösterilen yeni bir keşif yaptı. Biyomekanik sistemimiz uygun ilaç perfüzyon, canlı hücre görüntüleme, kalsiyum görüntüleme ve yama kelepçe yazmak ile birlikte kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntem mechanosensitive iyon kanalları, aksonlar Taşıma Yönetmeliği, aksonlar sitoiskeleti dinamikleri, sinyal kalsiyum ve morfolojik değişiklikler ile ilgili travmatik beyin hasarı eğitimi için kabul edilebilir.
Introduction
Varisler oluşumu veya şişlik/boncuk, akson, boyunca önemli bir özelliğidir birçok bozuklukları veya yaralanma multipl skleroz, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin gözlenen ateş ve travmatik beyin yaralanması1,2. Aksonal varicosities aksiyon potansiyeli yayma ve sinaptik iletimi3önemli fizyolojik etkileri rağmen varicosities nasıl oluşturulduğunu bilinmemektedir. Son zamanlarda, yeni kurulan microbiomechanical tahlil kemirgenler kültürlü Hipokampal neurons kullanarak, mekanik uyaranlara varicosities son derece ilginç özellikleri ile bu nöronlar içinde tetikleyebilir buldum. İlk olarak, varisler indüksiyon hızlı (< 10 s) ve bu işlem beklenmedik bir şekilde geri alınabilir. İkinci olarak, varisler başlatma basınç şişirme gücüne bağlıdır: yüksek basınç, hızlı başlatma. Üçüncü olarak, varisler başlatma nöronal yaş üzerinde bağlıdır. Genç nöronların aksonlar mekanik stres, büyük nöronlar için göre daha duyarlı görünür. Dördüncü olarak, süre dendrites ve ilk axon kesimleri bu nöronların Hipokampal nöronlar akson boyunca varicosities şeklinde değişiklik yok aynı şişirme koşul altında görüntüler. Böylece, bizim çalışma nöronal polarite roman bir özelliği ortaya koydu. Bu bulgular vitro sistemiyle fizyolojik ilgilidir. Vivo modeli hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) kullanarak, biz aksonal varicosities hemen sonra Kapat-kafatası etkisi, bizim vitro ile tutarlı fareler somatosensor korteks multifokal bir biçimde geliştirilen gösterdi sonuçları4. Boyama ve görüntüleme mTBI farelerin sadece bir görüntüsü nöronal morfolojik değişiklikler sağlamak, in vivo performans beri nöronal Morfoloji hızlandırılmış görüntüleme sırasında bir mekanik etkisi hala mümkün değil unutmamak önemlidir.
Bu sıvı şişirme sistem sadece mekanik stres kaynaklı varisler oluşumu ile ilgili benzersiz özellikleri yakalamak için ama aynı zamanda temel mekanizması belirlemek için izin verdi. Farklı hücre dışı çözümler, blokerler ve mechanosensitive iyon kanalları ve hücresel Elektrofizyoloji farklı adayların açacakları test ederek, biz geçici reseptör potansiyel katyon kanal bu alt familya V üye 4 (TRPV4) tespit Ca2 + ve Na+ geçirgen ve Şişirme tarafından aktive kanal aksonal varisler oluşumu4sırasında ilk mekanik stres algılamak için esas olarak sorumludur. Bu daha da bir siRNA nakavt yaklaşım ile doğrulandı. Birlikte, Hipokampal nöron kültürü ile hazırladığımız bu yeni tahlil sistem ele alındığında, diğer teknikleri ile birlikte özellikle merkezi nöronların micromechanical özelliklerini çalışmak için son derece değerlidir.
Biz kurduk bu micromechanical sistemi benzersizdir ve birkaç önemli yönü daha önce var olan sistemleri farklıdır. İlk olarak, bu sistemde nöronlar uçak mekanik stres sıkıştırma ve yamultma şekillerde deneyim. Mekanik etkisi sırasında nöronal süreçleri coverslip yüzeye bağlı kalır ve hareket etmiyor. Bu deneysel diğer esas olarak bükme ve uçak-germe dahil sistemleri (veya gerilim) farklıdır, örneğin, birlikte aksonlar saptırma gibi dizeleri5,6 taşıyarak veya micropatterned üzerinde yetiştirilen aksonlar yayarak kanalları ve gerilebilir membranlar7,8. Ayrıca, aksonlar varicosities da içinde indüklenen her ne kadar bu deneyleri gibi sistemimizde sıvı şişirme, bu ayarları sürecinde (üzerinden birkaç saat6,7,810 dk) çok daha fazla zaman alır ve görünür geri alınamaz. Son olarak, sistemimiz yerel sıvı şişirme kullanarak varisler oluşumu uzamsal özelliklerinin incelenmesi sağlar (örneğin., dendrites, dendritik omurgalar, soma, aksonlar ilk kesimleri, aksonlar terminalleri), zamansal özellikleri yanında. Bu sistemi kullanarak, biz birkaç beklenmedik ve benzersiz özellikleri aksonal varisler oluşumu, özellikle hızlı başlangıçlı, yavaş reversibility ve akson-dendrite polarite keşfetti.
Biz bu yazıda görüşmek sistem moleküler ile birçok teknikleri uyumludur ve hücre biyolojisi. Örneğin, nöronal morfoloji ve fonksiyonu mekanik stres etkileri çalışmaya, miyelin coculture ile birlikte, düşsel floresan rezonans enerji transferi (FRET) ve toplam iç yansıma floresan (TIRF), hızlandırılmış kullanılabilmesi için Kalsiyum görüntü ve yama kelepçe kayıt. Bu yazıda, sistemin çekirdek bileşenlerinin odaklanacağız. Hipokampal nöron kültürü, sıvı şişirme Kur, aksonlar taşıma için yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntü ve kalsiyum görüntüleme hakkında adım adım aşağıda gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu microbiomechanical tahlil düz ön işlemdir. Eğer onun adımları dikkatlice yürütülen güvenilir sonuçlar üretecektir. Uygun olmayan şekilde gerçekleştirdiyseniz, başarılı veri toplama engel olacak çeşitli anahtar adımlar vardır. Akıntıya karşı kritik adımlara başlamadan şişirme uyarıcı gerçek uygulamanın. Dikkatli diseksiyon, kültür ve bakım birincil nöron kültürünün olağanüstü vardır. Kültürlü nöronlar sağlıklı değilse, onlar zaten stres için astarlanmalıdır bu ya…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tüm hayvan deneyleri Ulusal kurumları, sağlık hayvan kullanım kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır. Bu eser kısmen C. Gu için Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01NS093073 ve R21AA024873) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
Riferimenti
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
