Изоляции и культуры грызунов микроглии для поощрения динамичного разветвленная словотолкование в среде Serum-free

Как макрофаги паренхимы ЦНС микроглии взаимодействуют с огромным набором схем нейронов и глиальных сигнальной сети. Они играют жизненно важную роль в развитии и гомеостаза головного мозга через синаптических обрезки, Распродажа apoptotic клеток и переходных взаимодействия с нейрональные процессы^1,2. Микроглии являются раннего реагирования неврологических травм, расширяя их длинные, тонкие процессы для поражения сайтов для координации воспалительных реакций и ограничить кровотечение^3,4. Изменения в микроглии морфологии и функции являются вездесущими в острых и хронических травм ЦНС, и микроглии экспонат изменения морфологии, локализации и проявление воспалительных медиаторов в разнообразных заболеваний Штатов¹. Человеческие генетические исследования показывают, что мутации, которые изменяют риска для нейродегенеративные заболевания часто преимущественно или исключительно выражаются микроглии в неповрежденной ЦНС, указывая на важную роль для микроглии в патогенезе заболевания или прогрессирование⁵ . Учитывая их известность в травм и болезней, углубление понимания биологии микроглии является приоритетной для разработки новые терапевтические подходы.

Многие критические достижения понимания биологии микроглии возникли путем экстраполяции методы и механизмы, обнаружили в исследованиях других групп населения макрофагов, включая методы культуры, профили выражение гена и определения функциональных / Морфологические государств. Хотя обобщенные макрофагов, функции часто разыгрывают неожиданными способами в пределах ландшафта ЦНС, микроглии сами по себе являются узкоспециализированными, выставляют разветвленной морфологии и уникальный ген выражение подпись, которая отличает их от других тканей макрофаги⁶. Микроглии есть линия, которая отличается от большинства других тканевых макрофагов; они колонизировать ЦНС во время ранних эмбриональных волны примитивных кроветворения и самостоятельно обновить на протяжении всей жизни, независимо от взносов от окончательного кроветворения⁷. Полностью зрелые ген выражение подпись взрослого микроглии достигается не до второго послеродовой неделю⁸. Экологические сигналы от окружающих тканей играют важную роль в диктует макрофагов ткани специфических особенностей⁶, которая в ЦНС включает ограниченное воздействие факторов кровь, предоставленные blood – brain барьер⁹.

Одним из препятствий для полного понимания микроглии вклад ЦНС гомеостаза и болезней является сложность изложив специализированные свойства зрелых микроглии видели в vivo с очищенной ячейки в пробирке. Многие методы были разработаны для изоляции и культуру нетронутыми микроглии, но большинство подходов полагаться на сыворотке поддержать выживание клетки. Мы показали, что добавление сыворотки, которая по своей сути переменной реагента, содержит широкий спектр биологически активных молекул, особенно проблематичным, когда работа с микроглии потому, что он способствует Саркодовые морфологии, увеличение распространения, и увеличение фагоцитоза⁹ часто видели в естественных условиях , когда Микроглия подвергаются воздействию факторов кровь после нарушения blood – brain барьер. От этих показателей, сыворотка подвергается клетки напоминают травмы или заболевания государств микроглии, но такие изменения уменьшаются когда Микроглии являются культивировали в определенный рост среднего, содержащий РСУ-1 (или IL-34), TGF-β, холестерин и селенит.

Этот протокол обеспечивает детали для культивирования несовершеннолетних крыса микроглии сыворотки свободных условиях, связанных с недавно опубликованной работе⁹. Этот протокол упрощен для крыс от послеродового день 21-30 (P21 – P30), но может быть адаптирована к изолировать микроглии от крыс и мышей, любого возраста, хотя доходности и общей жизнеспособности будет варьироваться в зависимости от вида и возраста животного. Максимальная урожайность и оптимальной эффективности достигается при использовании немного незрелых микроглии (~ P9), урожайность и жизнеспособности, постепенно сужающийся к несколько более низкого уровня в взрослых животных. Микроглии также могут быть изолированы от мышей, но мы обнаружили, что клетки крыс показывают значительно выше урожайность, жизнеспособность и сложности разветвленной морфологии, когда по сравнению с клетки мыши в сыворотке бесплатно культур. Животных в возрасте более чем P50 не были оценены с настоящим Протоколом. Эта процедура изоляции immunopanning была оптимизирована для сведения к минимуму изменения в микроглии транскрипционный анализ профиля при изоляции и максимального течению жизнеспособность клеток. С помощью этих методов и средств массовой информации формулировок, высокой жизнеспособности первичных культур может быть устойчивым на недели. Микроглии, культивируемых в этих условиях проявляют весьма разветвленная Словотолкование, быстрое расширение и втягивание процессов и относительно низкие показатели распространения. Мы подчеркнуть значимость сыворотки воздействия на эти свойства и обсудить сильные и слабость этого метода по сравнению с другими подходами.