Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

Als de macrofagen van de CNS parenchym, microglia interactie met een uitgebreid scala aan circuits van neuronale en gliale signalering netwerken. Ze spelen een cruciale rol in de ontwikkeling en de homeostase van de hersenen via synaptic snoeien, apoptotic cel goedkeuring en voorbijgaande interacties met neuronale processen^1,2. Microglia zijn vroege responders aan neurologische letsels, uitbreiding van hun lange, dunne processen naar laesie sites beperken bloeden^3,4te coördineren van inflammatoire reacties. Veranderingen in microglial morfologie en functie zijn alomtegenwoordig in zowel acute als chronische CNS verwondingen en microglia tentoonstelling gewijzigd morfologie, lokalisatie en expressie van inflammatoire mediatoren in een breed scala aan ziekte staten¹. Menselijke genetische studies blijkt dat mutaties die veranderen van risico voor neurodegeneratieve ziekten vaak voornamelijk of uitsluitend worden uitgedrukt door microglia in het intact VNV, wijzend naar een cruciale rol voor microglia in de pathogenese van de ziekte of progressie⁵ . Gezien hun bekendheid bij letsel en ziekte, is bevordering van het begrip van microglial biologie een hoge prioriteit voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen.

Vele kritische voorschotten aan het begrip van microglial biologie gerezen door extrapolatie van de technieken en mechanismen in het onderzoek van de populaties van andere macrofaag waaronder kweekmethoden, gen expressieprofielen en definities van functionele ontdekt / morfologische Staten. Hoewel generalized macrofaag functies vaak op verrassende manieren binnen de CNS-landschap spelen, microglia zelf sterk gespecialiseerd, vertonen een vertakte morfologie en een unieke gen expressie handtekening dat hen onderscheidt van ander weefsel macrofagen⁶. Microglia hebben een afkomst die verschilt van de meeste andere macrofagen weefsel; ze koloniseren de CNS tijdens een vroege embryonale Golf van primitieve Haematopoiese en zelf vernieuwen gedurende het hele leven, onafhankelijk van de bijdragen van definitieve Haematopoiese⁷. De volwassen gen expressie ondertekening van volwassen microglia wordt niet bereikt tot de tweede postnatale week⁸. Milieu signalen uit het omringende weefsel spelen een belangrijke rol in het weefsel-specifieke macrofaag functies⁶, waarin in het VNV beperkte blootstelling aan bloed overgedragen factoren die worden verleend door de bloed – hersenbarrière⁹dicteren.

Een obstakel voor het volledig begrip van microglial bijdragen aan CNS homeostase en ziekte is de moeilijkheid van de gespecialiseerde eigenschappen van volwassen microglia gezien in vivo met gezuiverde cellen Recapitulerend in vitro. Veel methoden zijn ontwikkeld om te isoleren en cultuur intact microglia, maar de meeste benaderingen rekenen op serum ter ondersteuning van de overleving van de cel. We hebben aangetoond dat toevoeging van serum, dat is een inherent variabele reagens met een breed scala van biologische actieve moleculen, is met name problematisch wanneer werken met microglia omdat het bevordert een Wortelpotigen morfologie, verhoogd proliferatie, en verhoogde fagocytose⁹ vaak gezien in vivo wanneer microglia worden blootgesteld aan bloed gedragen factoren na de verstoring van de bloed – hersenbarrière. Door deze statistieken, serum-blootgesteld cellen lijken op microglia letsel of ziekte staten, maar dergelijke veranderingen worden verlaagd wanneer microglia worden gekweekt in de gedefinieerde groeimedium met CSF-1 (of IL-34), TGF-β, cholesterol en seleniet.

Dit protocol biedt details voor het kweken van jonge rat microglia onder serumvrij voorwaarden, in verband met de onlangs gepubliceerde werk⁹. Dit protocol is gestroomlijnd voor ratten uit postnatale dag 21-30 (P21 – P30), maar kan worden aangepast aan het isoleren van microglia van ratten en muizen van elke leeftijd, hoewel opbrengst en algehele levensvatbaarheid is afhankelijk van de soort en de leeftijd van het dier. Maximale opbrengsten en optimale levensvatbaarheid wordt bereikt bij het gebruik van iets onvolwassen microglia (~ P9), met opbrengsten en levensvatbaarheid geleidelijk taps toelopende tot enigszins lagere niveaus in de volwassen dieren. Microglia kan ook geïsoleerd van muizen, maar we hebben gevonden dat de rat cellen tonen beduidend hogere opbrengsten, levensvatbaarheid en complexiteit van vertakte morphologies, in vergelijking met de muis cellen in serumvrij culturen. Dieren ouder groter is dan P50 zijn niet geëvalueerd met dit protocol. Deze immunopanning isolatie procedure is geoptimaliseerd om te minimaliseren van wijzigingen in microglial transcriptionele profielen tijdens isolatie en te maximaliseren downstream levensvatbaarheid van de cellen. Met behulp van deze technieken en media formuleringen, kunnen hoge-levensvatbaarheid primaire culturen weken worden volgehouden. Microglia gekweekt onder deze omstandigheden vertonen een zeer vertakte morfologie waarbij snelle uitbreiding en intrekking van processen en relatief lage tarieven van proliferatie. We wijzen op de betekenis van de serum-blootstelling op deze eigenschappen, en bespreken van de sterke punten en zwakheid van deze methode ten opzichte van andere benaderingen.