Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi
Summary
Bu makale hazırlanması ve doğal ürünler kullanmak üzere çeşitli uzun karşı Monoklonal antikor değerlendirilmesi için detaylı bir protokol sağlar. Bu yordam bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA olumlu klon eleme ve monoklonal Hibridoma hazırlık için içerir. Antikor karakterizasyonu MALDI-TOF-MS ve ELISA analizleri kullanarak spesifikasyonları da temin edilmektedir.
Abstract
Gıda ve doğal ürünler mevcut biyoaktif bileşenler analizi çalışma geleneksel Çin tıp ve gıda güvenliği/toksikoloji de dahil olmak üzere birçok alanda popüler bir alanı haline gelmiştir. Klasik analiz teknikleri çok pahalı ekipman ve/veya uzmanlık gerektirir. Özellikle, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISAs) gıda ve doğal ürünler analizi için gelişmekte olan bir yöntem haline gelmiştir. Bu yöntem hedef bileşenleri antikor aracılıklı tespiti dayanmaktadır. Ancak, birçok doğal ürünler biyoaktif bileşen olarak küçüktür (< 1000 Da) ve bağışıklık yanıtının neden değil, onlara karşı monoklonal antikorlar (mAbs) oluşturma genellikle zor. Bu protokol için biz mAbs karşı olanların bileşim içinde birden fazla örnekleri hızlı çözümlenmesi için ilişkili dolaylı rekabet (IC) ELISA oluşturmak için gerekli yanı sıra hedef molekülleri oluşturmak için gereken adımları ayrıntılı bir açıklama sağlar. Yordam, yapay antijen (Yani, hapten-taşıyıcı eşlenik) sentezi, aşılama, hücre füzyon, monoklonal Hibridoma hazırlama, mAb karakterizasyonu ve mAb ELISA tabanlı uygulama açıklar. Hapten-taşıyıcı eşlenik sodyum tarafından sentez yöntemi periodate ve MALDI-TOF-MS tarafından değerlendirilir. Bağışıklama sonra splenocytes aşılı fare ile en yüksek antikor titresi yalıtılmış ve hypoxanthine-aminopterin-timidin (şapka) – hassas fare miyelom hücre kültürünü Sp2/0 – Ag14 ile erimiş polietilen glikol (PEG) kullanarak-yöntemi dayalı. MAbs hedef antijen reaktif salgılayan hybridomas özgüllük ve olan icELISA tarafından gösterildi. Ayrıca, sınırlayıcı seyreltme yöntemi monoklonal hybridomas hazırlamak için uygulandı. Son mAbs daha da icELISA tarafından karakterize ve doğal ürünler içinde örnek hapten (naringin (NAR)) hızlı ve kolay tespiti için ELISA tabanlı bir uygulamada kullanılmaktadır.
Introduction
Monoklonal antikor (mAbs) olarak da bilinen mono özel antikorlar, tek bir B-lymphocyte klon üretilir ve tümünü aynı epitope1olarak bağla monovalent antikorların oluşmaktadır. Son yıllarda çok sayıda şifalı bitki kaynaklı doğal ürünler çeşitli hastalıklar2tedavisinde kullanılmaktadır. Gerçekten de, birçok küçük moleküler bileşikleri aslında doğal ürünlerden elde edilen şimdi artemisinin için sıtma ve paciltaxel (taxol) kanser2,3gibi ilk satır ilaçlar olarak uygulanır. Doğal ürünler çalışmanın çok büyük gelişme ve geleneksel analiz teknikleri, yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) ve kütle spektrometresi (MS) dahil olmak üzere en iyi duruma getirme büyük ölçüde nedeniyle hızlı ilerleme kaydetmiştir. Ancak, hala onların karmaşık tedavi öncesi iletişim kuralları ve ilgili maliyetler açısından zaman, emek/uzmanlık ve gerekli aletleri4gibi bu yöntemler ile ilgili bazı sınırlamalar vardır.
Son zamanlarda, mAb-esaslı enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISAs) gıda ve doğal ürünler niteliksel ve kantitatif analiz etmek için uygulandı. Aslında, bu yöntem hem biyolojik örnekleri analiz ve klinik test için uygulanan ve ayrıca diğer analizler5ileilgili sıkıcı tedavi öncesi adımlar kaçınırken doğru duyarlı ve son derece etkili olduğu gösterilmiştir, 6.
Monoklonal antikorların hazırlanması ELISAs mAb tabanlı karmaşık doğal ürünleri incelemek için kullanırken, çekirdek adımlardan biridir. Ne yazık ki, bu tür maddeler6,7,8,9,10,11,12 mevcut küçük biyoaktif bileşenler için özel mAbs ,13,14,15 kez sınırlı protein antijenleri ile karşılaştırıldığında. Bu sorunu aşmak için özellikle mAbs karşı küçük bileşikleri oluşturmak için bir protokol geliştirdik. Burada sunulan Protokolü yapay antijen sentezi, fare bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA ve monoklonal Hibridoma hazırlık içerir.
Özellikle, bizim araştırma grubu mAbs karşı geleneksel Çin ilaç üzerinden küçük biyoaktif bileşiklerin oluşumunu eğitim edilmiş ve yıl boyunca onların uygulamaları geliştirme. Çalışmalarımız devam mAbs baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic asit18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121ve birçok diğer küçük moleküller karşı geliştirdik. ELISA protokolümüze bu mAbs üzerinde çalışmalar bir dizi yanı sıra diğer biyoaktif bileşiklerin onların etkileşimleri bu küçük moleküller farmakokinetik değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ayrıca, bu mAbs kullanarak, ayrıca epimers de dahil olmak üzere yapısal analogları ayrılması için immunoaffinity Kromatografi yöntemler geliştirdik. Son zamanlarda, daha sonra hızlı, yerinde tespiti bu bileşik için kullanılan bizim anti-puerarin mAb kullanarak bir yanal akışı immunoassay hazırladık. Bizim sonuçları bizim mAb tabanlı deneyleri Biyoloji ve doğal ürün türevi bileşikler, özellikle içinde geleneksel Çin ilaç kullanılan kalitesini çalışmak için vazgeçilmez ve uygun araçlar olduğunu gösteriyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, mAbs doğal ürün kaynaklı küçük moleküller karşı başarılı üretim için bir iletişim kuralı mevcut. Temel adımları yordamda açıklanan olmuştur ve biz NAR bir örnek küçük molekül bu iletişim kuralı’nı yarar göstermiştir. Örnek spectra, reaktivite analizleri ve icELISA sonuçları temsilcisi deneysel ve bu iletişim kuralını kullanan elde edilen denetim verileri gösterir. Hybridomas örnek görüntüleri ne araştırmacı monoklonal ve poliklonal hybridomas arasında differentiating…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (grant numaraları 81573573, 81473338 ve 81503344) ve klasik reçete temel araştırma ekibi Beijing Üniversitesi’nde Çin tıbbı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Riferimenti
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
