Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali
Summary
Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione e la valutazione degli anticorpi monoclonali contro prodotti naturali per l’utilizzo in vari test immunologici. Questa procedura comprende l’immunizzazione, la fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto per clone positivo di screening e preparazione di ibridoma monoclonale. A vostra disposizione anche le specifiche per la caratterizzazione dell’anticorpo usando MALDI-TOF-MS e le analisi di ELISA.
Abstract
L’analisi dei componenti bioattivi presenti negli alimenti e prodotti naturali è diventata una popolare area di studio in molti campi, compreso il tradizionale cinese medicina e cibo sicurezza/tossicologia. Molte delle tecniche di analisi classica richiedono attrezzature costose e/o competenze. In particolare, le analisi enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) sono diventati un metodo emergente per l’analisi di alimenti e prodotti naturali. Questo metodo si basa sulla rilevazione dell’anticorpo-mediata dei componenti di destinazione. Tuttavia, come molti dei componenti bioattivi in prodotti naturali sono piccole (< Da 1.000) e non indurre una risposta immunitaria, creazione di anticorpi monoclonali (mAbs) contro di loro è spesso difficile. In questo protocollo, forniamo una spiegazione dettagliata dei passaggi necessari per generare anticorpi monoclonali contro molecole bersaglio, nonché quelli necessari per creare l'associato indiretta competitivo (ic) ELISA per l'analisi rapida del composto nei campioni multipli. La procedura descrive la sintesi dell'antigene artificiale (cioè, il coniugato aptene-carrier), immunizzazione, fusione cellulare, preparazione di ibridoma monoclonale, caratterizzazione del mAb e l’applicazione basata su ELISA del mAb. Il coniugato aptene-carrier è stato sintetizzato dal Sodio Metaperiodato metodo e valutati mediante MALDI-TOF-MS. Dopo immunizzazione, splenocytes sono stati isolati dal mouse immunizzato con il più alto titolo dell’anticorpo e fuso con il deficit di ipoxantina-aminopterina-timidina (cappello) – linea cellulare di mieloma mouse sensibile Sp2/0 – Ag14 utilizzando un polietilene glicole (spina)-metodo basato. Gli ibridomi secernenti anticorpi monoclonali reattivi all’antigene bersaglio sono stati selezionati dall’icELISA per la specificità e la reattività crociata. Inoltre, è stato applicato il metodo di diluizione limitante per preparare ibridomi monoclonale. MAbs finale sono stati ulteriormente caratterizzata da icELISA e poi utilizzate in un’applicazione basata su ELISA per la rilevazione rapida e conveniente dell’aptene esempio (naringina (NAR)) nei prodotti naturali.
Introduction
Gli anticorpi monoclonali (mAbs), noto anche come anticorpi mono-specifici, sono prodotte da un singolo clone di linfocita b e sono composti da monovalenti anticorpi che si legano al stesso epitopo1. Negli ultimi anni, molti prodotti medicinali vegetali naturali sono stati utilizzati nel trattamento di varie malattie2. Infatti, molti piccoli composti molecolari originariamente derivati da prodotti naturali vengono ora applicate come farmaci di prima linea, come ad esempio artemisinina per malaria e paciltaxel (taxolo) per cancro2,3. Lo studio di prodotti naturali ha fatto rapidi progressi, in gran parte dovuto l’enorme sviluppo e l’ottimizzazione delle tecniche di analisi convenzionali, tra cui la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e spettrometria di massa (MS). Tuttavia, ci sono ancora alcune limitazioni connesse con questi metodi, quali i loro complessi protocolli pretrattamento e costi associati per quanto riguarda il tempo, manodopera/competenze e strumenti necessari4.
Recentemente, sono stati applicati i saggi basati su mAb enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) analizzare qualitativamente e quantitativamente il cibo e prodotti naturali. In realtà, questo metodo è stato applicato per analisi di campioni biologici e per la sperimentazione clinica e ha dimostrato di essere accurati, sensibili e altamente efficiente, evitando anche le fasi di pretrattamento noiose connesse con altre analisi5, 6.
Quando si utilizza basato su mAb ELISAs per studiare prodotti naturali complessi, preparazione degli anticorpi monoclonali è uno dei passi fondamentali. Purtroppo, i mAbs specifici per i piccoli componenti bioattivi presenti in questi tipi di sostanze6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 sono spesso limitati rispetto agli antigeni della proteina. Per ovviare a questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per generare specificamente mAbs contro piccoli composti. Il protocollo presentato qui include sintesi artificiale dell’antigene, mouse immunizzazione, fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto e preparazione di ibridoma monoclonale.
In particolare, il nostro gruppo di ricerca ha studiato la formazione di anticorpi monoclonali contro piccoli composti bioattivi da medicine cinesi tradizionali e sviluppare le proprie applicazioni per anni. Nei nostri studi in corso, abbiamo sviluppato anticorpi monoclonali contro baicalin16, puerarin17, acido glicirrizico18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121e molte altre piccole molecole. I nostri protocolli di ELISA basati su questi anticorpi monoclonali sono stati utilizzati in una serie di studi per valutare la farmacocinetica di queste piccole molecole, come pure le loro interazioni con altri composti bioattivi. Inoltre, usando questi mAbs, abbiamo anche sviluppato metodi di cromatografia di immunoaffinità per la separazione di analoghi strutturali, inclusi epimers. Recentemente, abbiamo preparato un immunoassay di flusso laterale utilizzando il nostro mAb anti-puerarin che è stato successivamente utilizzato per il rilevamento rapido, in loco di questo composto. I nostri risultati indicano che la nostra analisi di mAb-based sono strumenti indispensabili e conveniente per studiare la biologia e la qualità dei composti naturali-prodotto-derivati, in particolare quelli utilizzati nelle medicine cinesi tradizionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un protocollo per il successo della produzione di anticorpi monoclonali contro naturale prodotto derivato di piccole molecole. I passi essenziali nella procedura sono stati delineati, e abbiamo dimostrato l’utilità di questo protocollo utilizzando NAR come una piccola molecola di esempio. Gli spettri di esempio, analisi di reattività e icELISA risultati tutti mostrano rappresentante sperimentale e dati di controllo che viene ottenuti utilizzando questo protocollo. Immagini di esempio degli ibridomi for…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da National Natural Science Foundation of China (sovvenzione numeri 81573573, 81473338 e 81503344) e il classico Team di ricerca base prescrizione presso l’Università di Pechino di medicina cinese.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Riferimenti
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