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Immunologia e infezioni

Optische Vollfeld-Kohärenzmikroskopie zur histologischen Analyse von Stromamerkmalen in Hornhauttransplantaten

Published: October 21, 2022
doi:
10.3791/57104
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1Vision Institute,Sorbonne University, UM 80 / INSERM, UMR_S 968 / CNRS, UMR_7210, 2Quinze Vingts National Ophthalmology Hospital, 3Laboratory of Ophthalmic Instrument Development, The Wilmer Eye Institute,Johns Hopkins University School of Medicine, 4Laboratory for Optics and Biosciences (LOB),École polytechnique, 5LOA – ENSTA Paris,École polytechnique

Summary

Wir beschreiben den Einsatz der optischen Vollfeld-Kohärenzmikroskopie als eine Methode zur qualitativ hochwertigen Beurteilung des Hornhautspenderstromas. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Merkmale zu identifizieren, die auf Gesundheit oder Krankheit hinweisen, und zielt darauf ab, das Screening und die Auswahl von Spendergewebe und damit die Ergebnisse der Keratoplastik zu verbessern.

Abstract

Die Qualität des Hornhautstromas des Spenders, das etwa 90 % der gesamten Hornhautdicke ausmacht, ist wahrscheinlich einer der wichtigsten, wenn nicht sogar der wichtigste, limitierende Faktor für den Erfolg einer tiefen anterioren lamellären und perforierenden Keratoplastik. Dabei handelt es sich um chirurgische Eingriffe, bei denen ein Teil oder die gesamten erkrankten Hornhautschichten durch gespendetes Gewebe, das Transplantat, ersetzt werden, das einer kürzlich verstorbenen Person entnommen wird. Die Möglichkeiten zur Beurteilung der Stromaqualität von Hornhauttransplantaten in Augenbanken sind jedoch begrenzt und es fehlt die Fähigkeit zur hochauflösenden quantitativen Bewertung von Krankheitsindikatoren. Die optische Vollfeld-Kohärenzmikroskopie (FF-OCM), die eine hochauflösende 3D-Bildgebung frischer oder fixierter biologischer Gewebeproben ex vivo ermöglicht, ist eine nicht-invasive Technik, die sich gut für die Beurteilung der Spenderhornhaut eignet. Hier beschreiben wir eine Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse des Hornhautstromas mittels FF-OCM. Das Protokoll wurde erfolgreich auf normale Spenderhornhäute und pathologische Hornhautknöpfe angewendet und kann verwendet werden, um gesunde und pathologische Merkmale sowohl auf makroskopischer als auch auf mikroskopischer Ebene zu identifizieren und so die Erkennung von Stromaerkrankungen zu erleichtern, die das Ergebnis einer Keratoplastik beeinträchtigen könnten. Durch die Verbesserung der Qualitätskontrolle des Transplantats hat dieses Protokoll das Potenzial, zu einer besseren Auswahl (und Abstoßung) von Spendergewebe und damit zu einem geringeren Transplantatversagen zu führen.

Introduction

Hornhauterkrankungen gehören weltweit zu den Hauptursachen für Erblindung1. Einige Krankheiten können nur chirurgisch behandelt werden, oft durch den Ersatz eines Teils (z. B. lamelläre Keratoplastik) oder der gesamten (d. h. perforierenden Keratoplastik) erkrankten Hornhaut durch gespendetes Gewebe, das Transplantat, das einer kürzlich verstorbenen Person entnommen wird. Bei Erkrankungen der Hornhaut, die das Endothel nicht betreffen (z. B. Keratokonus, Stromanarben nach infektiöser Keratitis, Trauma und Stromadystrophien), gilt derzeit die tiefe anteriore lamelläre Keratoplastik (DALK) als Operationstechnik der Wahl 2,3,4,5. Diese Technik ermöglicht die Erhaltung des Hornhautendothels des Empfängers, indem nur das zentrale Hornhautepithel und das Stroma ersetzt werden, was mit einer geringeren Inzidenz von Transplantatabstoßung, dem Fehlen einer endothelialen Abstoßung, einem geringeren Endothelzellverlust und einem günstigen Kosten-Nutzen-Verhältnis verbunden ist 6,7,8,9,10,11 . DALK ermöglicht außerdem die Verwendung von Hornhäuten mit nicht optimaler Endothelqualität als Transplantate, da diese beeinträchtigte Schicht nicht transplantiert wird12. Umgekehrt ist die Qualität des Hornhautstromas des Spenders wahrscheinlich der wichtigste limitierende Faktor für den Transplantaterfolg und die Wiederherstellung des Sehvermögens, da das Stroma die einzige verbleibende Hornhautschicht des Spenders ist, während das Spenderepithel durch das Empfängerepithel ersetzt wird. Leider sind die Möglichkeiten zur Beurteilung des Hornhautstromas von Spendern in Augenbanken begrenzt. Sie beinhalten in der Regel eine Spaltlampenuntersuchung des Spenderaugapfels bei Gewebeentnahme durch Enukleation und eine lichtmikroskopische Untersuchung des Spenderstromas13. Einige Augenbanken haben damit begonnen, solche Standardverfahren mit der optischen Kohärenztomographie im Fourier-Bereich (FD-OCT) zu ergänzen14.

Die ophthalmologische optische Kohärenztomographie (OCT), ein optisches Analogon zur Ultraschallbildgebung15, verwendet die Interferenz von breitbandigem oder abstimmbarem Licht, um optische Schnitte der Netzhaut 16 und des vorderen Abschnitts17 zu erzeugen. Bei der Zeitbereichs-OCT, der Grundlage früher klinischer Systeme, wird die Position eines Referenzspiegels verändert, so dass Interferenzmuster immer dann auftreten, wenn der Referenzstrahl fast die gleiche Zeit zurückgelegt hat wie der an den verschiedenen Gewebegrenzflächen reflektierte Strahl, wobei A-Bilder als Funktion der Zeit erzeugt werden. Bei der FD-OCT (auch Spektral- oder Frequenzbereichs-OCT genannt), der Basis der meisten modernen klinischen Systeme, wird der Referenzspiegel an einer Position fixiert und ein einzelnes A-Bild, bei dem alle Interferenzmuster miteinander vermischt sind, gleichzeitig aufgenommen und mittels Fourier-Analyse zerlegt.

Während klinische (Zeit- oder Spektralbereichs-) OCT-Systeme Schnittbilder der Hornhaut und die Detektion stromaler Trübungen mit einer höheren axialen Auflösung als die Spaltlampen-Biomikroskopie ermöglichen, ist ihre laterale Auflösung begrenzt. Die konfokale Mikroskopie18 ermöglicht die Untersuchung der Hornhaut mit einer lateralen Auflösung, die sich dem histologischen Detail annähert, ist aber axial begrenzt.

Die optische Vollfeld-Kohärenztomographie (FF-OCT oder FF-OCM)19,20 kombiniert Elemente der konfokalen Mikroskopie und der OCT und erreicht eine laterale Auflösung, die mit der axialen Auflösung von etwa 1 μm vergleichbar ist. Genauer gesagt verwendet FF-OCM inkohärente Breitbandlichtquellen (z. B. eine Halogenlampe) und Optiken mit hoher numerischer Apertur, um 2D-tomographische Bilder ohne laterale Abtastung aufzunehmen. Durch das Scannen in Tiefenrichtung ermöglicht FF-OCM eine nicht-invasive 3D-Bildgebung von frischen oder fixierten ex vivo biologischen Gewebeproben. Es wurde verwendet, um die Hornhautabzubilden 21,22,23. Durch die Bereitstellung von hochauflösenden En-Face– und Querschnittsansichten liefert FF-OCM Informationen sowohl über die histologische Struktur als auch über zelluläre Details der Hornhaut. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass FF-OCM strukturelle Informationen liefert, die der Histologie überlegen sind, und dass es in der Lage war, mehr Krankheitsindikatoren zu identifizieren, als dies mit der Kombination von Spektralbereichs-OCT und konfokaler Mikroskopie möglich war24,25.

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur qualitativen und quantitativen Beurteilung des Hornhautspenderstromas mittels FF-OCM. Die Methode basiert auf der histologischen Analyse makroskopischer und mikroskopischer Merkmale, die auf den Stromazustand hinweisen, einschließlich dreier quantitativer Stromaparameter (d.h. Bowmans Schichtdicke und ihre Variabilität sowie Stromareflektivität). Das beschriebene Protokoll wird daher auf normales und abnormales Hornhautgewebe angewendet und ermöglicht die Unterscheidung von erkranktem und normalem menschlichem Hornhautgewebe.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden nach den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und folgten den internationalen ethischen Anforderungen an menschliches Gewebe. Dabei handelte es sich um eine prospektive Fall-Kontroll-Beobachtungsstudie. Von den Patienten wurde eine informierte Einwilligung eingeholt. Es wurden keine Änderungen an den französischen Behandlungs- oder Nachsorgestandards vorgenommen. Die Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) wurde vom Patientenschutzausschuss, Ile-de-France V (14944), eingeholt. 1. Gewebeauswahl und -vorbereitung Wählen Sie die Hornhäute der Spender aus. Die im Organkulturmedium 26 gelagerten Spenderhornhäute werden für 3 Tage in ein mit Dextran supplementiertes Organkulturmedium übertragen, um eine Entwertung27 vor der FF-OCM-Bildgebung28 zu ermöglichen (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie die Proben vor. Positionieren Sie die in das Speichermedium getauchte Hornhaut mit dem Epithel nach oben in den Probenhalter. Legen Sie ein sauberes Siliziumdioxid-Deckglas (im Lieferumfang des Probenhalters enthalten) auf die Hornhaut und schließen Sie den Halter, indem Sie die Basis vorsichtig drehen, bis die Probe leicht abgeflacht und unter dem Deckglas immobilisiert ist, wodurch eine relativ gleichmäßige Bildfläche entsteht. Treffen Sie Vorkehrungen, um Luftblasen zu vermeiden. Tragen Sie eine dicke Schicht ophthalmologisches oder optisches Gel als Immersionsmedium auf das Deckglas auf. 2. FF-OCM-Initialisierung, Einrichtung und Bildaufnahme Initialisieren Sie das Gerät. Schalten Sie das Gerät ein, indem Sie den Netzschalter auf der Rückseite des Geräts betätigen. Das Aufleuchten einer grünen LED an der Vorderseite des Geräts zeigt an, dass das Gerät eingeschaltet ist. Schalten Sie den dedizierten Computer und die Halogenlichtquelle ein, indem Sie den Netzschalter an der Vorderseite betätigen. Starten Sie die Erfassungssoftware (siehe Materialtabelle), indem Sie auf die Desktop-Verknüpfung doppelklicken. Stellen Sie sicher, dass der Bildgebungstisch bis auf das bewegliche Fach frei ist. Klicken Sie dann auf “OK”, um die Motoren an der Eingabeaufforderung zu initialisieren. Ziehen Sie das Tray heraus und setzen Sie den Probenhalter in den dafür vorgesehenen Behälter ein, dann schieben Sie das Tray vorsichtig zurück. Richten Sie das Gerät ein. Geben Sie eine “Probenkennung” in das dafür vorgesehene Pflichtfeld ein; Geben Sie optional eine “Probenbeschreibung” und/oder “Studienbeschreibung” ein. Klicken Sie auf “Makrobild erfassen”, wenn Sie fertig sind, um einen Schnappschuss der Probe zu erstellen, der später für die seitliche Positionierung und Navigation verwendet werden kann. Wenn Sie zufrieden sind, validieren Sie das Bild an der Eingabeaufforderung, indem Sie auf “Ja” klicken, woraufhin das Gerät die Probenschale unter das Objektiv bewegt und eine automatische Anpassung durchführt. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskopobjektiv gut in das optische Gel eingetaucht ist, bevor Sie fortfahren. Besorge dir die Stapel. Wählen Sie den Reiter “Erkunden”, um eine Akquisition vorzubereiten. Bevor Sie einen Stapel von Bildern aufnehmen, navigieren Sie zur Mitte der Hornhaut, indem Sie den Joystick umsetzen oder manuell auf dem Bildschirm auswählen (d. h. indem Sie auf das rote Quadrat auf dem aufgenommenen Makrobild klicken und es an die gewünschte Stelle ziehen). Variieren Sie die Bildgebungstiefe durch Drehen des Joysticks, Einstellen des Schiebereglers oder manuelle Tastatureingabe in der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) und passen Sie den Mittelungswert an (für eine optimale Hornhautbildgebung wird im Allgemeinen eine Mittelung von 40 empfohlen).HINWEIS: Dies geschieht, um die Dicke der Hornhautprobe und die Mittelung zu bestimmen, die erforderlich ist, um die gesamte Hornhautdicke abzubilden, während die erste und letzte Bildposition in der Tiefe notiert werden. Die Unterseite des Deckglases erzeugt parallele Interferenzstreifen, die auf dem tomographischen Bild (auf der rechten Seite der GUI) zu sehen sind und die Lokalisierung der Hornhautoberfläche erleichtern. Geben Sie den Wert der Hornhautoberfläche oder die erste Bildposition in der Tiefe in das Feld “Tiefe” ein. Wählen Sie die Registerkarte “Erfassen”, um Bilder zu erfassen. Wählen Sie den “Schichtabstand” (die standardmäßige und empfohlene Einstellung ist 1 μm, entsprechend der axialen Auflösung des Geräts) und geben Sie unter “Anzahl der Schichten” den Wert für die Hornhautdicke entsprechend ein. Überprüfen Sie die Parameter und die Erfassungszeit, und wenn Sie zufrieden sind, drücken Sie “OK”, um die Erfassung zu starten. Vermeiden Sie während der Erfassung jeglichen Kontakt mit dem Tisch, auf dem das FF-OCM positioniert ist. 3. Verwaltung der aufgenommenen Bilder Anzeigen und Exportieren von Bildern. Starten Sie die FF-OCM-Anzeigesoftware (siehe Materialtabelle), indem Sie auf die Desktop-Verknüpfung doppelklicken. Aufgenommene Bilder (identifiziert durch die Proben-ID) werden in der Liste “Local Studies” angezeigt. Wählen Sie die Studie mit der entsprechenden Proben-ID aus, die sowohl das Makrobild als auch den erfassten Bildstapel enthält, und “exportieren” Sie letzteren, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Bildserie klicken und das Format “DICOM” auswählen, um die Rohdaten und Metadaten für die weitere Analyse zu speichern. Zeigen Sie die 3D-Bildstapel in Flächen – und Querschnittsansichten im MPR-Modus (Multiplanar Reconstruction) an, indem Sie auf die Bildserie doppelklicken. Navigieren Sie durch die Bilder (z. B. per Mausrad-Scroll oder Schiebereglereinstellung) und wählen Sie repräsentative En-Face – und Querschnittsansichten jedes Stapels aus. Exportieren Sie die ausgewählten Ansichten, indem Sie auf das Symbol unten rechts im Fenster klicken, und verwenden Sie das Format “DICOM”. Importieren Sie Bilder. Öffnen Sie die Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle) mit einem Doppelklick auf die Desktop-Verknüpfung und navigieren Sie unter “Plugins” zum “Bio-Formate” “Importer”, um DICOM-Bilder zu importieren; Stellen Sie sicher, dass im Fenster “Importoptionen für Bioformate” die Option “Dateien mit ähnlichen Namen gruppieren” ausgewählt ist. 4. Bildanalyse: Qualitative und quantitative Beurteilung der Morphologie und Merkmale des Stromas Beurteilen Sie die Dicke der Stroma- und Bowman-Schicht. Messen Sie Abstände manuell an Hornhautquerschnitten, beispielsweise an fünf gleichmäßig verteilten Punkten über den Querschnitt25.Ziehen Sie eine Linie zwischen zwei Punkten mit bekanntem Abstand (z. B. von links nach rechts des gesamten Bildes, d. h. gemäß dem Standard-Sichtfeld, 1.024 Pixel oder 780 μm), gehen Sie zu “Analysieren” und wählen Sie “Maßstab einstellen”, geben Sie den “Bekannten Abstand” und die “Längeneinheit” in die entsprechenden Felder ein und klicken Sie auf “OK”. Zeichnen Sie eine Linie zwischen zwei Punkten unbekannter Entfernung. Lesen Sie die gemessene Länge oder Distanz direkt aus der Statusleiste ab. Notieren Sie den Mittelwert und den Variationskoeffizienten (COV). Eine Bowman-Schichtdicke von weniger als 6,5 μm und ein COV von mehr als 18,6 % wurden mit einem abnormen Hornhautstroma in Verbindung gebracht25. Bestimmen Sie die Keratozytendichte. Befolgen Sie die Konvention der konfokalen Mikroskopie: Summieren Sie stromale En-Face-Bilder in Gruppen von 7 Stück, um Schichten vergleichbarer Dicke zu erzeugen. Gehen Sie dazu auf den Reiter “Bild” und wählen Sie unter “Stapel” “Reslice Z” aus. Berücksichtigen Sie die unterschiedliche (abnehmende) Zelldichte bei der Progression durch das Stroma24,25. Zu diesem Zweck kann das Stroma je nach Tiefe aus 4 Regionen zusammengesetzt werden: (1) das vordere Stroma unterhalb der Bowman-Schicht, d. h. 2 % der gesamten Stromadicke; das verbleibende Stroma (d. h. 98 % der gesamten Stromadicke) mit drei Zonen identischer Dicke: (2) vorderes Stroma, (3) mittleres Stroma und (4) hinteres Stroma. Für die weitere Analyse sind alle verfügbaren En-Face-Schichten für das vordere Stroma, 15 Bilder für das vordere Stroma, 5 Bilder für das mittlere Stroma sowie 5 Bilder für das hintere Stroma einzuschließen (wobei die Anzahl der Bilder pro Region, die für eine zuverlässige Zählung erforderlich ist, durch schrittweise Analysebestimmt wurde 29). Wählen Sie auf jedem En-Face-Bild einen 300 μm x 300 μm großen Bereich von Interesse aus. Um die Visualisierung des Kerns zu verbessern, invertieren Sie das Bild mit “Invertieren” auf der Registerkarte “Bearbeiten” und passen Sie Kontrast und Helligkeit an. Gehen Sie für letzteres auf “Bild” und navigieren Sie unter “Analysieren” zu “Helligkeit/Kontrast”. Manuelles Zählen von Zellkernen, z. B. mit der Funktion “Zellzähler”25. Gehen Sie dazu auf “Plugins” und navigieren Sie unter “Analysieren” zu “Zellzähler”. Drücken Sie auf “Initialisieren” und wählen Sie dann einen Zählertyp aus. Beginnen Sie dann mit der Zählung der Zellkerne, indem Sie auf dunkle ovale Merkmale im invertierten Bild klicken, wobei diejenigen berücksichtigt werden, die nur für zwei der vier Seiten des Bildes auf einem Bildrand landen25. Zeichnen Sie die Zelldichte in Form der Flächendichte auf, d. h. in Zellen/mm² (teilen Sie die Anzahl der gezählten Zellen durch 0,09, um sie von Zellen/90.000 μm² in Zellen/mm² umzurechnen), gemäß der konfokalen Mikroskopiekonvention, bei der sich gezeigt hat, dass die Keratozytendichten bei Patienten (z. B. mit Keratokonus) niedriger sind als bei gesunden Probanden und mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelieren25.HINWEIS: Weitere klinische Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob ein minimaler Schwellenwert der Keratozytendichte erforderlich ist, um nach der Transplantation ein perfekt klares Hornhauttransplantat zu erhalten. Beurteilen Sie das stromale Reflexionsvermögen. Erzeugen Sie mittlere Intensitätstiefenprofile von Stroma-Bildstapeln, z. B. mit der Funktion “Z-Achsen-Profil” und/oder der benutzerdefinierten Software25,30,31.HINWEIS: Hierbei handelt es sich in der Tat um Amplitudentiefenprofile, da FF-OCM die Amplitude des von der Probe zurückgestreuten Lichts und nicht deren Intensität misst.Berechnen Sie den mittleren Grauwert für jeden Flächenstapel. Subtrahieren Sie den minimalen Grauwert und normalisieren Sie durch den maximalen Grauwert. Anzeige in logarithmischer Skala als Funktion der Stromatiefe (% der Stromadicke). Approximieren Sie das resultierende logarithmische Profil durch eine lineare Regressionsgerade, die die Summe der quadrierten Residuen minimiert (Anpassung der kleinsten Quadrate). Notieren Sie den R-Quadrat-Wert (R²) als Maß für die Linearität. Werte unter 0,94 könnten ein Hinweis auf eine Hornhautpathologiesein 25.ANMERKUNG: Um die Unzulänglichkeit eines linearen logarithmischen Regressionsmodells (oder eines monoexponentiellen Zerfallsmodells) aufgrund des Vorhandenseins einer Pathologie aus bloßem Messrauschen zu unterscheiden, kann eine Signalanalyse durch Bayes’sche Inferenz durchgeführt werden31. Auch in Hornhäuten mit linearen logarithmischen (oder monoexponentiellen) Stromatiefenprofilen (z. B. dargestellt durch R-Quadrat-Werte30 oder Birge-Verhältnisse 31 nahe 1) kann die Berechnung des photonenmittleren freien Weges aus der Rate des Signalzerfalls verwendet werden, um den Grad der Transparenz31 weiter zu quantifizieren. Beurteilen Sie die Sichtbarkeit anderer Stromamerkmale und Krankheitsindikatoren. Prüfen Sie, ob Narben, fibrotisches Gewebe, Seen oder Vogtstreifen vorhanden sind. Beurteilen Sie die mittlere Dicke der Nerven im Stroma, wenn sie für die Messung ausreichend sichtbarsind 24.Wählen Sie ein Gesichtsbild aus, bei dem der Stromanerv am sichtbarsten ist (in der Regel in der mittleren Stromaregion). Messen Sie die Dicke des Nervs, z. B. an fünf Punkten24, und berechnen Sie dann den Mittelwert und die Standardabweichung. Nervendicken über 9 μm können ein zusätzlicher Indikator für eine Pathologie sein, wie z. B. Keratokonus24.

Representative Results

Das FF-OCM-Gerät (siehe Materialtabelle)28 und der allgemeine Aufbau, der in diesem Manuskript verwendet wird, sind in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt eine geschwollene menschliche Spenderhornhaut nach der Lagerung in Organkulturmedium, die ein pathophysiologisches Modell der ödematösen Hornhaut ergibt und aufgrund der begrenzten Eindringtiefe die FF-OCM-Bildaufnahme über die gesamte Hornhautdicke verhindert. Der Transfer in ein mit Dextran ergänztes Organkulturmedium führt zu einer Schwellung und zu Spenderhornhäuten normaler Dicke, wie in Abbildung 3 dargestellt. Erkrankte Hornhäute sind an morphologischen Veränderungen und typischen Stromamerkmalen zu erkennen, einschließlich einer verringerten und variablen Dicke des Stromas (Abbildung 4) und/oder der Bowman-Schicht (Abbildung 5). Die Beurteilung der Keratozytendichte (Abbildung 6) und des stromalen Reflexionsvermögens (Abbildung 7) kann bei der histologischen Analyse und Unterscheidung von normalem und pathologischem Hornhautgewebe mit FF-OCM weiter helfen, über die Möglichkeiten klinischer OCT-Systeme hinaus (Abbildung 8). Abbildung 1: Schematische Darstellung und Fotos des allgemeinen Aufbaus und des FF-OCM-Geräts, das in dieser Arbeit verwendet wurde. (A) Foto des FF-OCM-Geräts (siehe Materialtabelle)28. (B) Schematischer und optischer Aufbau des Geräts. (C) Foto einer menschlichen Spenderhornhaut im Probenhalter. (D) Zoomen Sie auf das Tauchobjektiv und den Probenhalter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Organkultivierte normale menschliche Hornhaut vor der Entlockung. Querschnitt (A) und En-Face-Ansicht (B, Schnitt durch das Stroma) der geschwollenen (“ödematösen”) Hornhaut, die durch die Einlagerung in Organkulturmedium verursacht wurde, wobei Seen als dunkle Bereiche zu sehen sind (wie durch Pfeile gekennzeichnet). Die Hornhautdicke hat sich auf über 1.100 μm verdoppelt, was eine Bildaufnahme über die gesamte Tiefe verhindert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Organkultivierte normale menschliche Hornhaut nach Entwertung. Querschnittsansicht durch die gesamte Hornhaut (A) und En-Face-Stroma-Ansicht (B) der geschwollenen Hornhaut, die in Dextran-komplementiertes Medium eingetaucht ist, mit regelmäßig verteilten hyperreflektiven (weißen) Keratozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Gesamtbewertung der Morphologie und der Merkmale des Stromas, einschließlich der Dicke des Stromas. Im Vergleich zu normaler menschlicher Hornhaut (A) weisen Hornhäute mit Keratokonus (B) eine verringerte und variable Stromadicke auf, zusammen mit zahlreichen, parallelen Vogt-Streifen, die in Querschnittsansichten als dunkle vertikale Bänder erkennbar sind, und dicken Stromanerven, die in mittelstromalen En-Face-Schnitten zu finden sind (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Beurteilung der Bowman-Schichtdicke, die anterior durch die hyperreflektive epitheliale Basalmembran und posterior durch die hyperreflektiven Keratozyten im vorderen Stroma abgegrenzt wird. Im Vergleich zu einer normalen menschlichen Hornhaut (A) weist die pathologische Hornhaut (z. B. Keratokonus) (B) aufgrund von Unterbrechungen und Narbenbildung eine verringerte und variable Bowman-Schichtdicke auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 6: Beurteilung der Keratozytendichte. (A) Keratozytenkerne werden nach Auswahl einer 300 μm x 300 μm großen Region von Interesse manuell auf verstärkten und invertierten En-Face-Bildern gezählt. (B) Gezählte Kerne sind durch Pfeile gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 7: Beurteilung der stromalen Reflektivität. Die Menge des rückgestreuten Lichts nimmt (exponentiell) mit der Tiefe im Stroma normaler Spenderhornhäute ab (siehe Abbildung 3 und Abbildung 4A), was zu linearen logarithmischen Tiefenprofilen führt, die durch R-Quadrat-Werte nahe 1 (grüne Kurve) dargestellt werden. Dies gilt möglicherweise nicht für pathologische Hornhäute mit Stromaregionen mit erhöhter Lichtrückstreuung (siehe Abbildung 4B). Das Vorhandensein solcher makroskopischen Merkmale, wie im Beispiel einer Hornhaut mit Stromanarbe nach infektiöser Keratitis (im Bildausschnitt dargestellt), erzeugt somit nichtlineare logarithmische Intensitätstiefenprofile, die durch einen R-Quadrat-Wert unterhalb eines bestimmten Schwellenwerts (z. B. kleiner als 0,9425; rote Kurve) dargestellt werden. Beachten Sie, dass logarithmische Amplitudentiefenprofile tatsächlich angezeigt werden, da FF-OCM die Amplitude des von der Probe zurückgestreuten Lichts und nicht deren Intensität misst.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 8: Demonstration der Vorteile von FF-OCM gegenüber Histologie und Spektralbereichs-OCT. (A) Histologie und (B) korrespondierendes Spektralbereichs-OCT-Bild, das auf derselben Hornhaut in vivo vor der Keratoplastik aufgenommen wurde. (C) Korrespondierender FF-OCM-Querschnitt des ex vivo Hornhautknopfes nach der Keratoplastik, der eine überlegene Auflösung im Vergleich zu den klinischen OCT-Bildern im Spektralbereich veranschaulicht. Die Fibrose ist auch in FF-OCM-Bildern deutlicher sichtbar als in der Histologie. Die hohe Dichte der Keratozyten im oberen Stroma ist sowohl in der (C)-Querschnitts- als auch in der (D) En-Face-Ansicht deutlich zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll zur qualitativen und quantitativen Beurteilung des Hornhautspenderstromas mittels FF-OCM basiert auf der histologisch anmutenden Analyse makroskopischer und mikroskopischer Merkmale, die auf den Zustand des Stromas hindeuten, über die Möglichkeiten der Spektralbereichs-OCT und der konfokalen Mikroskopiehinaus 21,24,25, und ermöglicht die Unterscheidung von erkranktem und normalem menschlichem Gewebe.

Abgesehen von einer exzellenten Beurteilung der Endothelqualität menschlicher Spenderhornhäute mittels Spiegelmikroskopie ist die Beurteilung der Stromaqualität in Augenbanken eine Herausforderung und beschränkt sich in den gängigen Protokollen im Allgemeinen auf eine grobe Betrachtung mit Spaltlampenbiomikroskopie und/oder Lichtmikroskopie. Das Fehlen einer feinen Auflösung mit den bestehenden Methoden bedeutet nicht nur, dass Hornhäute mit einer Stromaerkrankung ausgewählt werden können, die das Ergebnis der Keratoplastik beeinträchtigen, sondern auch, dass Hornhäute aufgrund von Stromatrübungen abgestoßen werden können, die tatsächlich auf das vordere Stroma oder die Epithelregionen beschränkt sind und immer noch für endotheliale Keratoplastikverfahren verwendet werden könnten14.

Das aktuelle Eye-Bank-Protokoll könnte durch die Hinzufügung von FF-OCM ergänzt werden, das aufgrund seiner überlegenen Auflösung ein leistungsfähiges und nicht-invasives Werkzeug darstellt, um die Qualitätsbeurteilung der Hornhaut, insbesondere des Stromas (einschließlich der Bowman-Schicht), zu vervollständigen. Anders als bei der Spaltlampenuntersuchung bleibt das Transplantat während der gesamten FF-OCM-Bildaufnahme in einer geschlossenen Kammer eingetaucht, die mit Speichermedium gefüllt ist, wodurch das potenzielle Kontaminationsrisiko verringert wird.

Für eine erfolgreiche Bildaufnahme mit FF-OCM (siehe Materialtabelle) ist es wichtig, dass das Mikroskopobjektiv gut in das optische Gel eingetaucht ist, das auf das Deckglas des Probenhalters aufgetragen wird (Schritt 2.2.3). Des Weiteren wird empfohlen, die Kalibrierung des Gerätes regelmäßig zu überprüfen, ein Verfahren, das auch nach erfolgloser Autojustage (Schritt 2.2.2) durchzuführen ist und über “Werkzeuge und Optionen” in der Erfassungssoftware aufgerufen wird (siehe Materialtabelle). Das Verfahren, bei dem ein Kalibrierspiegel im Probenhalter verwendet wird, ist das gleiche wie bei der üblichen Probenvorbereitung (siehe Schritt 1.2), mit der Ausnahme, dass das optische Gel vor dem Positionieren des Deckglases auf den Spiegel aufgetragen werden sollte.

Eine Reihe von Spender-Hornhauttransplantaten, die gemäß den bestehenden Augenbankverfahren als normal eingestuft wurden, wurden verwendet, um das Protokoll in diesem Manuskript zu beschreiben und insbesondere die Eignung von FF-OCM für eine präzise und zuverlässige Beurteilung der Spenderstromaqualität zu demonstrieren. Diese normalen Spenderhornhäute wurden mit pathologischen Hornhäuten verglichen, die in Speichermedium getaucht wurden, was zeigte, dass die histologieähnliche Analyse, die mit FF-OCM von mehreren Stromamerkmalen (dargestellt in Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 8) in Hornhauttransplantaten ermöglicht wurde, die Unterscheidung von erkranktem und normalem menschlichem Hornhautgewebe ermöglicht.

Neben morphologischen Veränderungen, wie Narben (Abbildung 5 und Abbildung 7), fibrotischem Gewebe (Abbildung 8), Seen (Abbildung 2), Vogtstreifen (Abbildung 4) oder erhöhtem Stromanervendurchmesser (Abbildung 4), sind typische Stromamerkmale in erkrankten Hornhäuten vorhanden. Stromale Parameter, die für die Beurteilung der Stromalqualität besonders relevant sind, scheinen die Bowman-Schichtdicke und ihre Variabilität sowie das Stroma-Reflexionsvermögen zu sein. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind daher die Schritte 4.1 und 4.3.

Während sie während der menschlichen Hornhautentwicklung sezerniert wird, wird insbesondere die Bowman-Schicht in der 19. Schwangerschaftswoche deutlich und repariert sich nach der Geburt nicht mehr32. Die Schädigung der Bowman-Schicht ist somit irreversibel und dient als idealer Indikator für frühere Stromaschäden im Hornhautgewebe des Spenders, einschließlich Schäden durch refraktive Chirurgie, infektiöse Keratitis, Keratokonus. Solche Hornhauterkrankungen, die Kontraindikationen für die Verwendung der Spenderhornhaut darstellen, sind mit einer verringerten und variablen Bowman-Schichtdicke aufgrund von Unterbrechungen und Narbenbildung verbunden (Abbildung 5) und werden wahrscheinlich von den aktuellen Augenbankprotokollen übersehen, wenn die Spendergeschichte nicht genau bekannt ist.

Obwohl die Transparenz der Hornhaut nach dem Tod des Spenders aufgrund eines postmortalen Hornhautödems beeinträchtigt ist, wird erwartet, dass die Menge des rückgestreuten Lichts oder die stromale Reflektivität mit der Tiefe im Stroma exponentiell abnimmt (siehe Abbildung 3 und Abbildung 4A). Infolgedessen ist der Logarithmus der normalisierten Stromareflektivität eine lineare Funktion der Stromatiefe in normalen Spenderhornhäuten, dargestellt durch R-Quadrat-Werte nahe 1. Umgekehrt ist das Vorhandensein makroskopischer Merkmale mit nichtlinearen logarithmischen Tiefenprofilen assoziiert und weist auf eine Stromaerkrankung hin (Abbildung 4B und Abbildung 7)25.

Da die Keratozytendichte für die Synthese und Erneuerung der stromalen Kollagenfibrille und der extrazellulären Matrix verantwortlich ist, liegt die Vermutung nahe, dass die Keratozytendichte ein weiterer relevanter Parameter für die Beurteilung der Stromaqualität des Spenders ist und dass Gewebe mit sehr niedrigen Keratozytenzahlen nicht transplantiert werden sollten. Das Protokoll enthält daher eine präzise und zuverlässige Methode zur Messung der Keratozytendichte aus FF-OCM-Bildern, die leicht in Augenbanken25 verwendet werden kann und der Konvention der konfokalen Mikroskopie folgt. Beachten Sie, dass mit FF-OCM die Keratozytendichte auch durch Zählen von Keratozyten direkt in der Querschnittsansicht33 bestimmt werden kann, ein potenzieller Vorteil gegenüber der konfokalen Mikroskopie, bei der Keratozyten auf mehreren En-Face-Schichten gezählt werden müssen. Anders als bei lebenden Patienten, bei denen sich gezeigt hat, dass die Keratozytendichten bei erkrankten Patienten niedriger sind als bei normalen Kontrollen 34,35,36,37 und mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelieren34,38, war dies bei menschlichen ex vivo Gewebeproben nicht der Fall 25 , und weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob eine minimale Anzahl von Keratozyten in der Spenderhornhaut erforderlich ist, um eine gute visuelle Erholung nach der Transplantation zu erreichen. Eine niedrige Keratozytendichte im Spendergewebe wie in pathologischem Gewebe könnte durch Alterung, postmortalen Zellverlust durch Ischämie und/oder Einlagerung von Spendergewebe erklärt werden 27,39,40,41. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass die normalen Spenderhornhäute, die in diesem Protokoll gewonnen und abgebildet wurden, entweder eingelagert und ödematös waren oder angeschwollen waren oder von der Augenbank vor der Transplantation wegen schlechter Endothelqualität gemäß den Standards der EU Eye Bank Association verworfen worden waren. Würde die FF-OCM-Bildgebung zusammen mit dem beschriebenen Protokoll in die Augenbankumgebung aufgenommen, würden die Hornhäute in der Regel in einem frischeren Zustand beurteilt werden, als dies hier möglich ist, was sich auf die Keratozytendichte auswirken kann.

Das hier beschriebene Protokoll für die Stromaqualitätsanalyse konnte für die Beurteilung der Descemet-Membran erweitert werden, die auch mit FF-OCM hinsichtlich Dicke und Struktur aufgelöst werden kann21,24. Dies kann sich als nützlich für die Auswahl von Geweben für die Descemet-Membran-Endothel-Keratoplastik erweisen, bei der dünne Descemet-Membranen schwieriger vom Stroma zu trennen sind.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass FF-OCM eine präzise und zuverlässige Beurteilung des Hornhautstromas eines menschlichen Spenders während der Lagerung ermöglicht. Durch die Verbesserung der Transplantatqualität hat die Ergänzung der derzeitigen Augenbankverfahren durch die Hinzufügung dieses Protokolls das Potenzial, das Screening und die Auswahl von Spendergewebe und damit die Ergebnisse der Keratoplastik zu verbessern. Die reale Integration des FF-OCM-Geräts in die Routine der Augenbank sollte durch die jüngsten technologischen Aktualisierungen erleichtert werden, einschließlich einer schnelleren Bildaufnahme und eines größeren Sichtfelds dank der Entwicklung einer kundenspezifischen CMOS-Kamera sowie des Designs kundenspezifischer steriler Einwegkassetten für die Aufbewahrung und Handhabung der Hornhaut während der Bildgebung.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Agence Nationale de Recherche (ANR) im Rahmen des PRTS (Projet de Recherche Translationelle en Santé) unter der Nummer ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) und aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 709104 (K.I.) gefördert. Die Autoren danken Céline de Sousa für ihre Hilfe bei der Zellzählung und der histologischen Verarbeitung.

Materials

Light-CT Scanner LLTech, France http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ FF-OCM device used in this manuscript for imaging
CorneaJet EuroBio, France http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html Organ culture medium in which donor corneas are stored
CorneaMax EuroBio, France http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence 
Fiji (ImageJ) National Institute of Health, Bethesda, MD, USA https://fiji.sc/ Open source image processing software
Matlab Mathworks, Inc., Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html Mathematical computing software
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Irsch, K., Grieve, K., Borderie, M., Vilbert, M., Plamann, K., Ghoubay, D., Georgeon, C., Borderie, V. Full-Field Optical Coherence Microscopy for Histology-Like Analysis of Stromal Features in Corneal Grafts. J. Vis. Exp. (188), e57104, doi:10.3791/57104 (2022).
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