Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione
Summary
Questo metodo può essere utilizzato per misurare la sintesi del RNA. 5-Bromouridine è aggiunto alle cellule e integrare nel RNA sintetizzato. Sintesi di RNA viene misurata mediante estrazione di RNA immediatamente dopo la marcatura, seguita da 5-Bromouridine-mirati immunoprecipitazione di etichettati RNA e analisi di trascrizione inversa e reazione a catena della polimerasi quantitativa.
Abstract
Quando livelli allo stato stazionario del RNA sono confrontati fra due condizioni, non è possibile distinguere se i cambiamenti sono causati da alterazioni nella produzione o degradazione del RNA. Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione della produzione di RNA, usando 5-Bromouridine etichettatura di RNA seguito da immunoprecipitazione, che consente l’indagine di RNA sintetizzato entro un breve lasso di tempo (ad es., 1h). Il vantaggio di 5-Bromouridine-etichettatura e immunoprecipitazione sull’uso di inibitori trascrizionali tossici, come α-amanitina e actinomicina D, è che ci sono no o molto bassi effetti sulla vitalità cellulare durante l’uso a breve termine. Tuttavia, poiché 5-Bromouridine-immunoprecipitazione acquisisce solo RNA prodotta entro il breve tempo di etichettatura, lentamente prodotta così come rapidamente degradato RNA può essere difficile da misurare da questo metodo. Il RNA 5-Bromouridine-labelled catturato da 5-Bromouridine-immunoprecipitazione può essere analizzato da trascrizione d’inversione, reazione a catena della polimerasi quantitativa e sequenziamento di nuova generazione. Tutti i tipi di RNA possono essere indagati, e il metodo non è limitato alla misura mRNA come è presentato in questo esempio.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitazione (IP) permette lo studio della produzione di RNA nelle cellule con no o molto limitati effetti su cellule fisiologia durante il breve periodo1,2di etichettatura. Il metodo si basa di incorporazione del derivato sintetico uridina BrU in RNA recentemente sintetizzato seguita da IP di RNA etichettato usando gli anticorpi anti-BrU (Figura 1).
È stato conosciuto per decenni quella sintesi della proteina possono essere regolata trascrizionalmente e l’esistenza di fattori di trascrizione è stata supposta più di 50 anni fa3. Oggi, è noto che molte malattie sono causate da disregolazione della trascrizione e della stabilità del RNA (complementare figura S1 in riferimento4), e la capacità di misurare le variazioni nella produzione di RNA è di grande importanza nella malattia di comprensione sviluppo.
D’altra parte, strumenti per regolare la produzione di RNA offrono nuove possibilità per il trattamento di malattie causate da troppo o troppo poco l’espressione della proteina, o accumulo di proteine come nella malattia di Parkinson (PD). La proteina predominante accumulando aggregati come insolubili nel PD è α-synuclein, e il livello di α-synuclein è direttamente legato alla malattia, come la moltiplicazione del gene del gene α-synuclein causa familiare PD5. Inoltre, α-synuclein aggrega in un modo dipendente dalla concentrazione. Downregulation dei livelli di mRNA di α-synuclein è quindi un’interessante strategia terapeutica, che è stato raggiunto con successo usando l’interferenza del RNA per ridurre la perdita di un neurone delle cellule nel PD modelli del roditore6,7.
È importante essere in grado di misurare i cambiamenti nella produzione di RNA causata da malattia o interventi terapeutici. Metodi all’avanguardia per misurazione livelli allo stato stazionario di RNA, come trascrizione d’inversione seguita da reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR), non sono in grado di distinguere tra i cambiamenti causati da regolazione trascrizionale o da alterato Stabilità del RNA. Un metodo ampiamente usato per le indagini dei tassi di decadimento di RNA è il blocco dell’apparato trascrizionale utilizzando composti come α-amanitina o actinomicina D seguita da misure del RNAs decadente. Tuttavia, ci sono alcuni problemi connessi con un blocco generale di trascrizione nelle cellule, come induzione di apoptosi8,9. Al lato degli effetti citotossici, trascrizionali inibitori presentano anche diversi problemi tecnici, come lento assorbimento cellulare di α-amanitina e mancanza di specificità di actinomicina D (rivisto in riferimento10).
Per evitare il blocco generale della trascrizione, nucleotidici sono stati utilizzati, quali 5-Etinil uridina (5-UE), 4-thiouridine (4-TU) e BrU. Questi sono prontamente presi dalle cellule di mammifera e integrare nel RNA recentemente sintetizzato, Abilitazione impulso-etichettatura di RNA entro un lasso di tempo specifico. BrU è meno tossico che 5-UE e 4-TU, che lo rende il preferito analogo scelta11,12.
BrU-IP può essere utilizzato per indagare sia il tasso di sintesi di RNA e di stabilità e così distinguere tra le cause alla base dei cambiamenti nel RNA totale. Questo articolo si concentrerà sulla misurazione della sintesi del RNA e si riferisce per fare riferimento a2 per i dettagli sull’indagine di stabilità del RNA. Per studiare la sintesi del RNA, cellule brevemente sono etichettate con BrU ad es. per 1 h seguita da BrU-IP1 (Figura 1). Questo permette di eseguire misure di RNA sintetizzati entro il breve tempo di etichettatura e cambiamenti osservati verranno darà una stima migliore dei regolamenti nella sintesi di RNA che misurando i cambiamenti in RNA totale da RT-qPCR. Va ricordato, tuttavia, che anche se la data di etichettatura è, ad esempio, solo 1 h, degradazione può ancora avere un’influenza sui livelli di RNA osservata.
RNA da esperimenti di BrU-IP sono adatte per analisi a valle sia RT-qPCR1 o di prossima generazione sequenziamento2,13. Altri metodi di rilevamento standard di RNA, come Macchiarsi nordico o analisi della protezione della ribonucleasi, possono anche essere applicabile per certo RNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive l’uso di BrU-IP per determinazione della produzione di RNA mediante etichettatura di recente prodotte RNA per 1 h con BrU, seguita da estrazione di RNA immediata e immunoprecipitazione di RNA BrU-etichettati. Questo metodo precedentemente è stato descritto nel riferimento16, e in questo articolo include alcuni passaggi aggiuntivi per aumentare la specificità IP e purezza RNA, dai branelli di pre-trattamento con basse concentrazioni di BrU, nonché una fase di purificaz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Fondazione di Lundbeck, Università di Aarhus, Dandrite e Lundbeck a/s sostenuto questo lavoro.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
Riferimenti
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