Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica
Summary
En este protocolo, baculovirus es producida por transitorios de la transfección del plásmido de baculovirus en células Sf9 y amplificado en una cultura de suspensión libre de suero. El sobrenadante es purificado por cromatografía de afinidad de heparina y más concentrado por ultracentrifugación. Este protocolo es útil para la producción y purificación de baculovirus para el uso de la terapia génica.
Abstract
Baculovirus se ha utilizado tradicionalmente para la producción de proteínas recombinantes y vacunas. Sin embargo, más recientemente, baculovirus se perfila como un prometedor vector para el uso de la terapia génica. Aquí, el baculovirus es producido por transitorios de la transfección del plásmido baculovirus ADN (bacmid) en una cultura adherente de células Sf9. Baculovirus se amplía posteriormente en células Sf9 en una cultura de suspensión libre de suero hasta obtener el volumen deseado. Luego se purifica de la cultura de sobrenadante mediante cromatografía de afinidad de heparina. Sobrenadante el virus es cargado en la columna de heparina que se une partículas de baculovirus en el sobrenadante debido a la afinidad de la heparina por baculovirus envuelven glicoproteína. La columna se lava con un buffer para eliminar los contaminantes y baculovirus es eluida de la columna con un amortiguador de sal. El eluido se diluye a una concentración isotónica de sal y baculovirus partículas están más concentrados mediante ultracentrifugación. Usando este método, baculovirus puede ser concentrado hasta 500-fold con una recuperación del 25% de partículas infecciosas. Aunque el protocolo descrito aquí muestra la producción y purificación de los baculovirus de culturas hasta 1 L, el método puede ser escalado-para arriba en una cultura de suspensión de sistema cerrado para producir un vector de tipo clínico para uso de la terapia génica.
Introduction
Baculovirus se utiliza principalmente para la producción de proteínas recombinantes y vacunas en lepidópteros Spodoptera fugiperda (Sf) 9 células de los insectos mediante el uso de recombinante virus de poliedrosis nuclear multicapsid de Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. más recientemente, se perfila como un prometedor vector gene terapia aplicación5. Es conocido por tener un amplio tropismo tejido y host, infecta las células quiescentes y proliferación, es no patógena y no integrar en el anfitrión cromosomas4,5,6. Además, se pueden producir baculovirus en cultura de suspensión libre de suero que es escalable y permite para sistema cerrado de procesamiento para la producción futura clínica1.
La pureza de las partículas de los baculovirus es importante para el logro de transducción eficaz minimizando la citotoxicidad7,8,9. Baculovirus puede concentrarse por ultracentrifugación o filtración de flujo tangencial (TFF) con impacto limitado en su infectividad. Sin embargo, estos procedimientos no sólo concentran las partículas del virus sino también detritos celulares y proteínas de Sf9 de la cultura, que pueden ser tóxicos en vitro (observación personal) y pueden inducir inflamación o respuesta inmune cuando se usa en vivo. Para evitar esto, sobre todo cuando uso altamente concentrado acciones de virus, baculovirus infecciosas debe ser purificado y separado de las partículas de contaminantes.
Varios métodos se han divulgado para la purificación y concentración de vectores de baculovirus10,11,12. De los métodos disponibles, cromatografía de afinidad de heparina permite un solo paso alto nivel de purificación con la baja concentración de contaminantes proteínas12. El método se basa en la identificación del sulfato del heparan como receptor de baculovirus13,14. Después de cargar el sobrenadante de células Sf9 sobre la columna y la vinculación de baculovirus, se puede lavar la columna con tampón fisiológico (isotónica) para eliminar partículas contaminantes ligeramente consolidadas o no consolidadas. Puesto que la Unión a la heparina es reversible, partículas de baculovirus pueden eluidas con un tampón salino alto, que se diluye inmediatamente a la concentración de sal (bebidas isotónica) fisiológica para evitar la inactivación por choque osmótico12. Por otra parte, la producción de baculovirus, así como captura en y la elución de la columna de cromatografía, se puede realizar mediante un proceso de sistema cerrado que es compatible con las actuales buenas prácticas de manufactura (cGMP).
Presentamos un protocolo detallado para la fabricación, purificación y concentración de baculovirus infecciosas mediante centrifugación y cromatografía de afinidad. Brevemente, producimos baculovirus por transfección de células Sf9 con un ADN de plásmido de baculovirus en cultura adherente y ampliar el baculovirus infecciosa en cultivo de suspensión libre de suero. Purificar el baculovirus mediante cromatografía de afinidad de heparina y usar ultracentrifugación como paso final para altamente concentrado el vector para el uso de la terapia génica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo que presentamos describe la producción de baculovirus en células Sf9 en cultura de suspensión y purificación de baculovirus mediante una cromatografía de afinidad de heparina. Los parámetros utilizados en el presente Protocolo maximizan el rendimiento y minimizan la inactivación de baculovirus infecciosas. El protocolo que aquí se muestra que una recuperación significativamente mayor de partículas de baculovirus en comparación con recuperaciones alcanzada por otros9.
<p…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado en parte por la financiación de puesta en marcha de Fundación de investigación de niños de Cincinnati (CCPR) M.N. y el innovador núcleo Grant (ICG) apoyado por el centro nacional para avanzar las Ciencias traslacional de los institutos nacionales de salud en Premio número UL1 TR001425. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
Riferimenti
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