Summary

Производства и очистки бакуловирусы для применения генной терапии

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

В этом протоколе бакуловирусы производится переходных трансфекции бакуловирусы плазмида в Sf9 клетки и усиливается в культуре подвеска сыворотки бесплатно. Супернатант очищается хромотографией сродства гепарин и далее сосредоточена на ultracentrifugation. Этот протокол используется для производства и очистки бакуловирусы для генной терапии приложения.

Abstract

Бакуловирусы традиционно используется для производства рекомбинантных белков и вакцины. Однако совсем недавно, бакуловирусы становится перспективным вектор для генной терапии приложения. Здесь бакуловирусы производится переходных трансфекции бакуловирусы плазмидной ДНК (bacmid) в адэрентных культуры клеток Sf9. Бакуловирусы впоследствии расширены в Sf9 клеток в культуре сыворотки бесплатные подвески до получения нужного тома. Затем он очищается от культуры супернатанта, используя хромотографию сродства гепарина. Вирус супернатанта загружается на столбце гепарина, который связывает частицы бакуловирусы в надосадке благодаря близости гепарина для бакуловирусы окутывать гликопротеина. Столбце вымывается с буфером для удаления загрязнений и бакуловирусы этого eluted из столбца с высоким содержанием соли буфера. Элюата разводят в изотоническом концентрации соли и бакуловирусы частиц дальнейшего концентрируется с помощью ultracentrifugation. С помощью этого метода, бакуловирусы может быть сосредоточено до 500-fold с 25% восстановления инфекционных частиц. Хотя протокол, описанные здесь демонстрирует производства и очистки бакуловирусы от культур до 1 Л, метод может быть увеличен в закрытой системе подвески культуре производить клинико класса vector для генной терапии приложения.

Introduction

Бакуловирусы используется главным образом для производства рекомбинантных белков и вакцин в lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 насекомых клеток с помощью рекомбинантной californica Металловидка multicapsid ядерных polyhedrosis вирус (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. совсем недавно, она становится перспективным вектор для генной терапии приложения5. Это известно широкой хост и ткани тропизма, заражает покоя и пролиферирующих клеток, непатогенные и не интегрироваться в принимающей хромосомы4,5,6. Кроме того бакуловирусы могут быть произведены в сыворотки бесплатно подвеска культуры, которая является масштабируемой и позволяет для закрытой системы обработки для будущих клинических производства1.

Чистота бакуловирусы частиц имеет важное значение для достижения эффективного трансдукции при сведении к минимуму цитотоксичность7,8,9. Бакуловирусы может быть сконцентрирован на ultracentrifugation или тангенциальная фильтрация (TFF) с минимальным воздействием на его инфективности. Однако, эти процедуры не только сосредоточиться частицы вируса, но также сотовой мусора и белки от Sf9 культуры, которые могут быть токсичными в пробирке (личное наблюдение) и может вызвать воспаление или иммунного ответа при использовании в естественных условиях. Чтобы избежать этого, особенно когда с использованием высоко концентрированный запасов вируса, инфекционные бакуловирусы необходимо быть очищенной и отделены от загрязняющих частиц.

Были зарегистрированы несколько методов для очищения и концентрации бакуловирусы векторов10,,1112. Из имеющихся подходов гепарин аффинной хроматографии позволяет для единый этапа высокого уровня очистки с низкой концентрацией загрязняющих белки12. Метод основан на определении heparan сульфат как рецептора бакуловирусы13,14. После загрузки Sf9 клеток супернатант на столбец и привязка бакуловирусы, столбец можно мыть с физиологической (изотонические) буфера для удаления несвязанного или слабо связанного загрязняющих частиц. Поскольку привязки гепарина является обратимым, можно этого eluted бакуловирусы частицы с высокой соли буфер, который сразу же разбавляют в физиологические (изотонические) концентрации соли для предотвращения инактивации осмотическим шоком12. Кроме того производство бакуловирусы, а также захват на и элюции в столбце хроматографии, могут выполняться с использованием закрытой системе процесс, который совместим с текущей надлежащей производственной практики (cGMP).

Здесь мы предоставляем подробный протокол для производства, очистки и концентрация инфекционных бакуловирусы, используя хромотографию сродства и центрифугирования. Кратко мы производим бакуловирусы по transfection клеток Sf9 с бакуловирусы плазмидной ДНК в адэрентных культуре и далее расширять инфекционных бакуловирусы сыворотки бесплатно подвеска культуры. Мы очистить бакуловирусы используя хромотографию сродства гепарин и использовать ultracentrifugation в качестве последнего шага высоко сконцентрировать вектор для генной терапии приложения.

Protocol

Смотрите Рисунок 1 для иллюстрации подведение протокол. 1. Очистка бакуловирусы плазмидной ДНК Расти бактериальной культуры, содержащие baculoviral плазмида ДНК (bacmid)14 200 мл бульона фунтов антибиотиков; канамицин (50 мкг/мл), тетрациклином (10 мк?…

Representative Results

Протокол представил находится в схема (рис. 1). Шаги включают переходных transfection клетки Sf9 с bacmid ДНК, чтобы произвести бакуловирусы адэрентных культуры в тарелку, последующей амплификации сыворотки бесплатно подвеска культуры, нуклеиназы лечения и уточн…

Discussion

Протокол, представленные здесь описывает производства бакуловирусы в Sf9 клеток в культуре подвеска и очистки бакуловирусы используя хромотографию сродства гепарина. Параметры, используемые в настоящем Протоколе максимальной урожайности и свести к минимуму инактивации инфекционных …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа частично поддерживается первоначальное финансирование от Цинциннати детей исследовательский фонд (УК РФ) м.н. и инновационные Core Грант (ГСИ) поддерживается Национальным центром для продвижения трансляционная наук национальных институтов здравоохранения под Номер УЛ1 TR001425 премии. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Materials

Akta Avant 150 GE Healthcare 28976337 Chromatography system
POROS Heparin 50 µm Column ThermoFisher Scientific 4333414 Heparin column
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Non-catalog item Concentrates virus at high-speed
Polyallomer Ultracentrifuge tube Beckman-Coulter 326823 Concentrates virus at high-speed
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
250 mL Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
1 L Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238072 Flask for suspension culture
Microscope (Olympus CKX41) Olympus Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of Baculovirus supernatant
6-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Tissue culture treated plate
10-cm plate ThermoFisher Scientific 08-772E Tissue culture treated plate
Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF EMD-Millipore SCHVU05RE Filtration unit
Kanamycin ThermoFisher Scientific 15160-054
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15750-060
Bac-to-Bac Vector Kit ThermoFisher Scientific 10360-014 Baculovirus expression system
DH10B-T1R  Competent cell ThermoFisher Scientific 12331-013 Competent cell for bacmid
TE buffer In-house Non-catalog item 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kit ThermoFisher Scientific K2100-06 For bacmid purification
Sf9 Cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Grace’s Insect Cell Culture Medium ThermoFisher Scientific 11605-094 Transfection medium
PBS ThermoFisher Scientific 20012227 Washing cells, diluting samples
HyClone SFX-Insect cell media GE Healthcare SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Baculovirus plasmid (bacmid) DNA In-house Non-catalog item Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II  ThermoFisher Scientific 10362 Transfection reagent for insect cells
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4737 Stabilizes Baculovirus
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For storage of Baculovirus
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Wash buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride
Elution buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride
Column cleaning buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride
Sterile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For Akta Avant cleaning

Riferimenti

  1. Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
  2. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  3. Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
  4. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  5. Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
  6. Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
  7. Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
  8. Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
  9. Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
  10. Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
  11. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
  12. Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
  13. Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
  14. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  15. Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
  16. Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
  17. Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
  18. Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
  19. Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
  20. Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).

Play Video

Citazione di questo articolo
Nasimuzzaman, M., van der Loo, J. C., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. J. Vis. Exp. (134), e57019, doi:10.3791/57019 (2018).

View Video