Grande surface balayage sonde nanolithographie facilitée par alignement automatisé et son Application à la Fabrication de substrat pour les études de Culture de cellules

1. fabrication du tableau stylo PPL Pour préparer le mélange de copolymère polydiméthylsiloxane (PDMS) : Ajouter 10 µL de la platine (0) – 1, 3 – divinyl-1,1,3,3-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane solution complexe et 172 µL de 1,3,5,7-tétraméthyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane à 250 g de (7-8 % w/w vinylmethylsiloxane)-diméthylsiloxane co-polymère. Mélanger ces composants soigneusement sur un mélangeur rotatif pendant 7 jours afin d’assurer un mélange homogène.ATTENTION : platine (0) – 1, 3 – divinyl-1,1,3,3-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane est toxique. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique. Ajouter 0,5 g de (25-35 % w/w methylhydrosiloxane)-diméthylsiloxane co-polymère à une portion de 1,7 g de mélange de l’étape 1.1.1 pour une pesée en bateau et bien mélanger avec une spatule. Une solution contenant ce mélange en transférant à un dessiccateur à vide et en exposant le mélange à basse pression (200 mTorr, 0,3 mBar) pendant 20 min jusqu’à ce que toutes les bulles de gaz sont soient dissipées. Place une lame de verre de 13 x 13 mm dans un flacon Garni vis en plastique remplie de 20 mL 2-propanol, puis placez le flacon dans un bain ultrasonique pendant 10 min enlever tout débris. Laver les diapositives en immergeant les diapositives de la fresh 2-propanol (100 mL) et sécher sous un courant d’azote gazeux. Place un silicium maîtriser18 dans un plat de Pétri de 4 cm de diamètre et ajouter suffisamment dégazé mélange prépolymère PDMS (à l’étape 1.1) jusqu’à entièrement couvert. En règle générale, il faut 100 µL pour un master de 20 x 20 mm. Placez le master avec le mélange prépolymère dans un dessiccateur sous vide. Dégazer le polymère pour un autre 5 min pour enlever les bulles de gaz formés lors du transfert du mélange. Le traitement au plasma2 O des lames de verre (étape 1.4 ci-dessous) doit être effectué alors que le dégazage se déroule. Traiter les carrés de verre avec du plasma de2 O (600 mTorr) à la puissance maximale RF pendant 1 min pour éliminer toute contamination organique et générer une couche uniforme d’oxyde sur le verre pour l’adhérence de l’élastomère. 19 utilisation du plasma traité diapositives immédiatement à l’étape suivante. Placer soigneusement la lame de verre carrés (de l’étape 1.4) sur le prépolymère sur le maître (de l’étape 1.3) avec le côté décapés plasma vers le bas. Appuyer doucement la lame de verre dans le masque de silicium pour enlever tout l’air emprisonné tout en assurant qu’une couche uniforme de PDMS est pris en sandwich entre le capitaine et la diapositive. Place le tableau PDMS sandwich par dessus pas dans une boîte de Pétri avec du silicium maîtriser au fond (c’est-à-dire, avec le dos de la lame vers le haut) et placer le plat dans un four à 70−80 ° C 24−48 h traiter thermiquement le PDMS. Retirer le tableau guéri du four et laisser refroidir pendant 15 min, puis avec une lame de rasoir avec précaution Retirez tout excès PDMS à l’arrière et les côtés du verre glissent et utilisent un courant d’azote sec pour souffler les débris PDMS.Remarque : attention de ne pas rayer le maître de silicium avec la lame de rasoir, car cela pourrait endommager le revêtement antiadhésif. Caler une lame de rasoir dans le coin de la baie sur une profondeur de 1 mm et dégager délicatement le tableau mis à part le maître. Effectuer cette opération en une seule action de levage continue ; ne laissez pas les baies à se replier sur le maître. Soigneusement coupée et grattez 0,5 mm du PDMS sur les bords du tableau avec une lame de rasoir. Utilisez un courant d’azote sec pour souffler les débris PDMS.Remarque : Il peut être plus facile d’exécuter cette étape de la coupe sous le stéréoscope ou une loupe. Attention de ne pas rayer le maître de silicium avec la lame de rasoir, car cela pourrait endommager le revêtement antiadhésif. 2. préparation et montage de substrat de tableau Générer une surface hydrophile sur le tableau de la sonde par traitement au plasma O2 : Place le tableau de stylo PPL dans une boîte de Pétri en chambre plasma puis appliquer le vide à 600 mTorr. Mettre en marche le générateur de plasma (réglage maximum) pendant 30 s. Libérer le vide, retirez le tableau et vérifiez son hydrophilicité en supprimant 20 µL d’eau déionisée dans le tableau et observer s’il y a même de répandre de l’eau sur toute la surface. Si cela ne fonctionne pas, sous réserve du tableau à un deuxième tour de traitement au plasma. Ensuite, séchez le tableau soigneusement avec un courant de gaz d’azote sec. À l’aide de ruban adhésif double-face carbone, fixer le tableau au milieu de la titulaire de la sonde. Fixer le support de sonde sur le support cinématique de l’AFM (Figure 2). Pour alimenter le tableau PPL avec 16-mercaptohexadecanoic acide (MHA) (« encrage ») : Préparer 1 mM 16-mercaptohexadecanoic acid (MHA) solution en dissolvant 8,6 mg dans 30 mL d’éthanol dans un tube et placer dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes dissoudre complètement le composé.ATTENTION : 16-mercaptohexadecanoic acide est toxique. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique. À l’aide d’une micropipette, déposer 20 goutte µL de la solution MHA sur le tableau. Eviter tout contact des pointes de pipette avec les baies. Laisser se propager tout au long de la baie, et ensuite laisser l’éthanol s’évapore dans des conditions ambiantes.Remarque : Le tableau PPL peut alternativement être signé après que l’alignement a eu lieu. 10 Une fois la solution MHA a séché, montez le support de sonde avec le tableau PPL sur l’AFM. 3. préparation des substrats or pour le PPL. Substrats or peuvent être achetés ou faits maison par thermique ou électrons dépôts du faisceau et sont construits d’une couche d’adhérence titane nm 2 suivie de 20 nm d’or sur une plaquette de silicium ou de verre. 18 Si nécessaire, nettoyer les substrats par traitement au plasma oxygène en utilisant les paramètres décrits à l’étape 1.4. Placez le substrat d’or au milieu de la scène d’échantillon AFM et fixez-la avec du ruban adhésif autour des frontières du substrat (Figure 2). Ajuster la scène à la bonne hauteur, comme indiqué dans la notice d’utilisation du fabricant, en utilisant le z-contrôleur d’axe. 4. automatique alignement du tableau de stylo Ouvrez et exécutez le contrôleur de stage programme d’installation (SetupNSF.exe) sur l’ordinateur de réinitialiser (« zéro ») tous les axes et angles à un précalibré point zéro, puis utiliser la scène x/y-axe manette console pour passer le substrat à l’alignement souhaité / position d’impression. Pour des résultats optimaux, le substrat doit être placé près du centre de la scène, entre les capteurs de force de la scène.Remarque : dans certains modèles d’ordinateur, le x/y-signal d’axe contrôleur USB peut interférer avec celui de la z-contrôleur d’axe. Si cela se produit, débrancher le x/y-contrôleur d’axes USB câble après cette étape. Il devrait ensuite être reconnectée après la procédure d’alignement (étape 4.7). Basculer le levier de dégagement du stade pour libérer la scène de l’échantillon et activer la triade des capteurs de force, comme indiqué par les instructions du fabricant de l’AFM. Laisser les capteurs de force s’équilibrer pendant au moins 15 min. Pour des résultats optimaux, permettent de 30 à 50 min. Augmentez la hauteur de l’axe z pour mettre le tableau en étroite proximité avec le substrat en observant visuellement le tableau de la sonde et la surface.Remarque : Plus le tableau est à la surface, les moins d’itérations sont nécessaires pour le processus d’alignement, économisant ainsi du temps. Ouvrir/exécuter le programme d’alignement automatique (Auto alignement v16.exe) et entrez les paramètres pertinents de l’alignement dans le programme. Entrez la valeur du paramètre désiré « Angle escalier », en général de 0,15 °. Ce paramètre est l’angle de décalage de l’angle « optimal » pour chaque axe est déterminée par le programme. Définissez ce paramètre entre 0,1 et 0,2 °, comme les angles inférieurs à cette plage n’aboutissent pas à une différence de force clairement décelables à l’approche des sondes à la surface.Remarque : Logiciel accepte des valeurs au millièmes (c’est-à-dire, 1 x 10-3 °). Par exemple, pour 0,15 °, les utilisateurs devraient entrer ‘150. » Entrer dans l’étape de grossiers souhaitée ‘ valeur du paramètre, en général 0,6 µm. Ce paramètre est la taille de palier d’axe z utilisée par la phase approche les sondes dans l’alignement initial rugueux. Définissez ce paramètre entre 0,2 et 1 µm. Larger étape diminution des tailles le temps pris par le processus d’alignement, mais réduire la précision de l’alignement et augmenter l’usure sur les sondes.Remarque : Logiciel accepte des valeurs d’étapes grossiers en micromètres. Par exemple, pour 0,6 µm les utilisateurs doivent entrer « 0,6’. Entrez la valeur du paramètre « Belle étape » désirée, généralement de 0,2 µm. Ce paramètre est la taille de palier d’axe z utilisée pour le réglage fin de l’alignement optimal. Pour la plupart des applications, affectez à ce paramètre entre 0,1 et 0,4 µm. valeur étape de taille va diminuer la quantité de temps nécessaire pour que le processus d’alignement mais réduisent la qualité de l’alignement.Remarque : Logiciel accepte des valeurs de mesures fines en micromètres. Par exemple, pour 0,2 µm, les utilisateurs devraient entrer « 0,2 ». Configurer le « chemin du fichier Excel » et joindre une copie non modifiée du fichier tableur fourni modèle en utilisant l’icône « dossier », accédant à l’emplacement du fichier, en appuyant sur « OK ». Ce fichier contient les données brutes et calculées qui sert à déterminer les angles d’inclinaison stade optimum de la scène. Ouvrir/exécuter le logiciel de contrôle d’AFM. Accédez à la composante de spectroscopie de ce programme en cliquant sur le bouton « spectroscopie » (selon les instructions du fabricant) et définissez l’AFM scan tête axe des z à osciller de 10 µm de plus de 100 ms, avec un temps de pause de 250 ms, puis pour rentrer à 10 µm plus de 100 ms avec un temps de pause de 250 ms (Figure 3). Comme la tête de l’AFM est oscillante, cliquez sur le bouton « start » du logiciel alignement pour commencer le processus d’alignement automatisé. Lorsque le programme est en cours d’exécution, le logiciel est écrit et lit des données dans le fichier décrit dans l’étape 4.4.4.Remarque : L’alignement dure entre 30 min et 3 h selon la position de l’étape initiale définie à l’étape 4.3 et configuration du logiciel qui ont été saisis à l’étape 4.4.ATTENTION : Les consoles de contrôleur de scène sont toujours actifs au cours du processus d’alignement – ne pas les utiliser pendant le processus d’alignement car il interférerait avec l’alignement. Fin de l’alignement, la zone de feu vert « Alignement complΘtΘ » sur le logiciel d’alignement (de l’étape 4.4) s’allume. Lorsque cela se produit, cliquez sur le bouton « STOP » sur l’interface utilisateur pour terminer le processus d’alignement. Inspecter les graphiques dans le fichier de modèle de feuille de calcul pour une corrélation entre des points de données enregistrées et la ligne d’ajustement qui est généré par le logiciel. Voir les résultats représentatifs pour obtenir des exemples d’une bonne corrélation, avec des valeurs de2 R > 0,99. Si l’alignement est infructueuse, remplacer le tableau de la sonde avec un tableau nouvellement préparé (étape 2) et répétez l’alignement (étape 4.4). Déplacer la scène vers le haut dans le z-axe à l’aide de la console du contrôleur stade de cet axe. La scène doit être déplacée en incréments de 500 nm jusqu’à ce que le contact peut être observée de la caméra vue de dessus de l’AFM. Contact entre le tableau et le substrat peut être observée comme un « point blanc » de contraste élevé au sommet des pyramides sonde individuels. À ce stade, cliquez sur le bouton « stop » sur le logiciel de contrôle d’AFM pour arrêter le programme de spectroscopie de l’étape 4.5. Cela se rétracte le tableau de 10 µm, ce qui laisse 10 µm de prolongement de l’axe z possible. Vérifier l’image de la caméra vue de dessus du manuel de vol pour s’assurer que les sondes ne sont pas en contact avec le substrat. 5. lithographie de stylo polymère (PPL) Accédez à la composante de lithographie du logiciel de contrôle en cliquant sur « Lithographie » sur le logiciel de contrôle. Choisir le z-modulation mode de fonctionnement et importer un matricielles (bitmap) ou vector image qui sera utilisée comme le modèle de la lithographie. Afin de générer les caractéristiques indiquées dans les résultats représentatifs, utiliser une bitmap composé de 20 x 20 pixels noirs (voir documents supplémentaires), correspondant à la lithographie d’une grille de 20 x 20 points par sonde sur le tableau PPL. Entrez les paramètres de la lithographie dans la fenêtre « Importation graphique Pixel » du logiciel contrôleur AFM. Configurer la « taille » de la pattern doit être généré, par exemple, 40 µm de longueur et largeur. Ces paramètres indiquent la largeur et la longueur sur laquelle l’image dans l’image bitmap sera mise à l’échelle. Pour générer les caractéristiques indiquées dans les résultats représentatifs, utilisez une largeur et une longueur de 40 µm dans les deux dimensions. Définir le « origine » du modèle doit être généré à 25 µm sur l’axe x et de y . Ces paramètres déterminent le centre de l’image par rapport au centre de l’AFM de x/y-axes. Régler ces paramètres afin d’éviter la région de la surface où les sondes ont été en contact au cours du processus d’alignement. Définir l’impression « Paramètres ». Ces valeurs déterminent comment les sondes doivent être prolongée (c.-à-d. mis en contact avec la surface) en réponse à chaque pixel de l’image bitmap. Sélectionnez dans le menu déroulant « Modulation Abs Z Pos » et « Simplifier à » deux couches. Ce mode indique à l’AFM d’étendre les sondes par une distance absolue déterminé par seulement deux résultats, « Black (0) » ou champs « Blanc (1) ». Définissez les valeurs dans les champs de « White (1) » et de « Black (0) » à 5 et -5 µm, respectivement. Ces valeurs déterminent la distance les sondes doivent être déplacés en réponse à un pixel noir ou blanc sur l’image bitmap et sont généralement placés entre 3 et 5 µm pour « Noir » (c.-à-d., étendre les sondes vers le bas de cette distance par rapport au zéro point de cet axe) et -3 à-5 µm pour « White » (c’est-à-dire, retirer les sondes vers le haut de 3 à 5 mm par rapport au point zéro).Remarque : Ces distances représentant supposent qu’une extension de 5 µm se traduit par les sondes entrant en contact avec la surface et donc la génération d’une fonction, alors qu’un retrait de 5 µm soulève les sondes à distance de la surface d’où aucun contact. Z-extension affecte la fonction taille en déterminant l’étendue de la sonde de contact avec le résultat de la surface, plus les extensions dans les sondes étant enfoncé davantage dans la surface, résultant en plus grandes fonctionnalités. 10 Cliquez sur le bouton « OK » pour implémenter ces paramètres et fermer la fenêtre. Entrer dans le « temps de pause » dans la fenêtre de lithographie du logiciel de contrôle AFM, typiquement de 1 s. Ce paramètre détermine la longueur de temps que les sondes restent en position déployée « Noir », qui est généralement située entre 0.1 et 10 s.Remarque : Les temps de pause plus longs donne de taille plus longs en raison de la plus grande quantité de MHA transporté à la surface d’or. On trouvera des précisions sur le contrôle de la taille des éléments générés dans d’autres rapports. 20 Préparer le boîtier de contrôle atmosphérique. Abaissez la chambre d’isolement atmosphérique sur l’AFM et ouvrir/exécuter le logiciel de contrôle atmosphérique fourni par le fabricant (MHG_control.exe). Configurez le logiciel de contrôle atmosphérique pour maintenir une humidité relative de 45 %, une température de 25 ° C et un échange d’atmosphère « Débit » de 500 mL en entrant ces valeurs dans le logiciel. Cliquez sur « Utiliser » pour implémenter les paramètres. Le module de contrôle atmosphérique commence alors à pomper de l’air humidifié dans la chambre.Remarque : Des niveaux plus élevés d’humidité donne dans les grandes tailles de caractéristique due à la formation d’un ménisque de l’eau plu généré entre la surface et les tableaux de stylo. 21 cette valeur est généralement définie entre 40 et 60 %. Le débit est généralement défini entre 300 et 500 mL. Flux plus importants permettent d’atteindre plus rapidement le niveau d’humidité désiré mais est moins précis. Les résultats représentatifs utilisent un débit de 500 mL pour la génération initiale de l’humidité et est réduite à 300 mL en arrivant à l’humidité souhaitée, afin de maintenir un niveau stable et précis au cours de la lithographie. Une fois l’humidité souhaitée obtenue, démarrer la séquence lithographique en appuyant sur le bouton « Démarrer » sur l’interface du logiciel. À l’issue de la lithographie, utilisez la console de contrôleur de scène axe z pour déplacer le substrat de la matrice en rétractant la scène de 500 µm. Supprimez la chambre d’isolement atmosphérique de sa monture. Basculer le levier de dégagement du stade pour verrouiller la scène de l’échantillon et de désactiver les capteurs de force, comme l’indique le manuel de vol du fabricant, puis retirer le substrat de la scène. 6. visualisation du modèle Modèles peuvent être visualisées à l’aide de l’une des méthodes suivantes, latéral force eau-forte chimiques ou la microscopie de sonde à balayage. Balayer la surface à motifs sur AFM avec mode de force latérale à l’aide de cantilever mode de contact pour examiner les caractéristiques non destructive.Remarque : La microscopie à force latérale peut être utilisée comme une méthode non destructive de visionner les caractéristiques produits par lithographie de polymère de plume ; Cependant, en utilisant cette méthode, seulement une zone relativement petite peut être visualisée (typiquement 100 x 100 µm). Étant donné que le député provincial déposé peut agir comme une résistance d’etch, gravure chimique peut être utilisée pour enlever la médaille d’or des zones non texturés. Les zones qui en résulte ne peuvent puis être visualisés par microscopie optique, ce qui signifie qu’une vaste zone peut être visualisée à la fois. 18NOTE : Substrats qui sont gravés de cette façon ne peuvent ensuite servir pour les expériences de culture de cellules suivantes décrites ci-dessous. Séparément, préparer les solutions aqueuses de thiourée 40 mM, nitrate de fer (III) de 27 mM et 100 mM d’acide chlorhydrique. Préparer le gel de mordançage en mélangeant 5 mL de chacune de ces trois solutions. Fraîchement mélanger avant chaque utilisation. 22ATTENTION : thiourée, nitrate de fer (III) et l’acide chlorhydrique sont toxiques. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique. Transvaser le substrat à motifs dans une boîte de Pétri et pipette solution etchant suffisante dans le plat pour couvrir la surface du substrat (généralement 10 mL). Garder le substrat immergé pendant 4-5 min vers etch 15 nm de l’or (à un taux approximatif de 3 nm/min). Une fois la gravure terminée, retirer le substrat et rincer soigneusement à l’eau puis sécher avec un courant d’azote.Remarque : L’achèvement du processus de gravure est déterminé par l’épaisseur d’or surface obtenue (étape 3.1) associée à la vitesse de gravure spécifiée (étape 6.2.2). Examinez les fonctionnalités or gravées sous microscopie optique lumineux. Les fonctionnalités d’or restantes qui restent doivent apparaître correspondantes au modèle qui a été imprimé (de l’étape 5.2). Si la totalité de la surface apparaît homogène, cela indique qu’il restait une importante quantité d’or et l’étape de gravure (étape suivante 6.2.2) doit être répété pendant 1-2 min. 7. modèle fonctionnalisation avec la fibronectine Plonger les substrats à motifs dans une solution de 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) dans l’éthanol pendant 1 h. laver le substrat trois fois avec de l’éthanol et sécher sous un courant d’azote. Cette étape Atotech les zones or supprimées.ATTENTION : hexa(ethylene glycol) (11-mercaptoundecyl) est toxique. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique. Submerger les substrats dans une solution aqueuse de2 Co (NO3) pendant 5 min de 10 mM. Ensuite, retirez les substrats de la solution, laver trois fois avec de l’eau ultrapure et sèche sous un courant d’azote sec.ATTENTION : Co (NO3)2 est toxique. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique. Plonger le substrat dans une solution de 50 µg/mL de la fibronectine dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et incuber à 4 ° C pendant 16 h. laver le substrat trois fois avec du PBS, puis sécher le substrat sous un courant d’azote sec.Remarque : La fibronectine est liée à MHA fonctionnalisés au moyen de la chélation du Co (II) par les groupes de terminal acide carboxylique la MHA. La fibronectine lie ensuite à Co (II) via son domaine de liaison au collagène. 23 Si vous le désirez, visualiser la fibronectine de surface-bondissent par étiquetage avec des anticorps fluorescents : Appliquer une solution de 2 mL d’anticorps primaire d’anti-fibronectine lapin non conjuguée au 1/100 à 5 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS à la surface et incuber à 4 ° C pendant 16 h. aspirer le surnageant et laver trois fois avec du PBS. Submerger le substrat dans une solution de 2 mL de conjugué fluorescent anti-lapin anticorps secondaire (à la dilution de spécifiée par le fabricant, 2 gouttes/mL) dans 5 % (p/v) de BSA dans du PBS, couvrir de papier d’aluminium et laisser incuber à température ambiante pendant 1 h. aspirer le surnageant et laver trois fois avec du PBS. Enregistrer les images de microscopie d’épifluorescence des fonctionnalités à l’aide d’un microscope à fluorescence selon les instructions du fabricant, avec un filtre d’excitation la valeur 594 nm. 8. cell culture sur surfaces nanofabriquées Préparer une suspension de CSM bien caractérisé qui se situent entre le 4ème et 6ème passage. 24 Suspendre une fiole confluente de cellules en rinçant une fois 10 ml de PBS, dissocier les cellules adhérentes en ajoutant 5 mL de trypsine/EDTA dans le flacon de culture tissulaire T75 et incuber la fiole dans une chambre humidifiée à 37 ° C, additionnée de 5 % de CO2 jusqu’à 5 min jusqu’à 90 % o les cellules de f sont détachés de la surface. Par la suite, ajouter 6 mL de milieux de culture fraîche contenant 10 % de sérum de veau foetal (FCS) dans la fiole et brièvement rincer le ballon avec les médias ajoutés. Transfert en suspension de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 400 g à 25 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 3 mL de milieux de culture fraîche. Compte de la densité des cellules à l’aide d’un hémocytomètre25 et ajuster la densité de la suspension cellulaire à 2 x 104 cellules/mL par l’addition d’un volume approprié de milieux de culture. Les semences des cellules sur des substrats à une densité de 104 cellules/cm2. Couper le substrat en 1 x 1 cm2 avec scribe diamant et placez-le dans un puits dans la plaque de culture de tissu de 12 puits. Pipette de 2 mL de suspension cellulaire dans les milieux de culture (de l’étape 8.1.4) dans le puits et incuber dans une chambre humidifiée à 37 ° C, additionnée de 5 % de CO2 pendant 24 h. Après la croissance des cellules sur les patrons, analyser l’ampleur de la fixation des cellules et qui se propage par immunofluorescence : Retirez les supports et laver les substrats une fois avec du PBS. Fixer les cellules avec 2 mL d’une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS (préalablement chauffé à 37 ° C) pendant 20 min dans la hotte et les laver trois fois avec du PBS.ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique. Permeabilize les cellules avec 2 mL d’une solution de détergent de 0,5 % (voir la Table des matières) dans du PBS pendant 15 minutes, puis laver trois fois avec du PBS. Submerger le substrat dans 2 mL d’une solution d’anticorps primaire de lapin non conjugués anti-fibronectine à une dilution de 1/100 avec 5 % (p/v) : BSA dans du PBS et incuber à 4 ° C pendant 16 heures, puis laver trois fois avec 0,1 % (v/v) Tween 20 dans PBS (PBST). Par la suite submerger le substrat dans 2 mL d’une solution de fluorescent conjugués anticorps secondaire anti-lapin (dilué avec 5 % (p/v) BSA dans du PBS à dilution spécifiée par le fabricant, à 2 gouttes/mL), couvrir de papier d’aluminium et laisser incuber à température ambiante pendant 1 h, puis laver trois fois avec 0,1 % PBST. Pour étiqueter les filaments d’actine, submerger 2 mL de phalloïdine fluorescent conjuguée à une dilution de 1/250 en PBS, couvrir de papier d’aluminium et incuber à 4 ° C pendant 30 min puis laver trois fois avec du PBS. Simultanément, détachant des noyaux cellulaires et monter le substrat en appliquant une goutte de montage moyen contenant DAPI et recouvrir d’un lamelle couvre-objet. Visualiser les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence selon les instructions du fabricant, avec des filtres d’excitation de 365 nm pour les noyaux (DAPI), 488 nm pour l’actine F et 594 nm pour la fibronectine.