ניטור-לתא שידור של אגרגטים חלבון פריאון-כמו בדרוזופילה Melanogaster
Summary
לצבירת ראיות תומך ברעיון כי אגרגטים חלבון פתוגניים המשויך מחלות ניווניות להפיץ בין תאים עם תכונות כמו פריון. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת ויזואליזציה בהפצת לתא של פריון כמו אגרגטים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה.
Abstract
צבירת חלבון הוא מאפיין מרכזי של רוב מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD) נוירודגנרטיביות (ALS). אגרגטים חלבון קשורים קשר הדוק עם neuropathology במחלות אלה, למרות המנגנון המדויק שבו צבירת חלבון aberrant משבש הומאוסטזיס סלולרית רגילה לא ידוע. מתעוררים נתונים מספקים תמיכה חזקה על ההשערה את צבירות פתוגניים לספירה, PD, HD, ALS יש קווי דמיון רבים כדי prions, שהינם חלבונים בלבד מדבקים אחראי encephalopathies spongiform מדבקות. Prions עצמית שכפל באמצעות תבניות ההמרה של מקופלת מקורי גירסאות של החלבון אותו, גורם התפשטות פנוטיפ צבירה. איך prions וחלבונים כמו פריון לספירה, מהלך PD, HD ו- ALS מתא אחד למשנהו הוא כיום שטח של חקירה אינטנסיבית. כאן, מתואר מודל דרוזופילה melanogaster המאפשר ניטור של שידור כמו פריון, מתא לתא של אגרגטים מוטציה huntingtin (Htt) המשויך HD. מודל זה מנצל כלים רבי-עוצמה מניפולציה transgene ביטוי ברקמות דרוזופילה שונות רבות, מנצל חלבון cytoplasmic מתויג fluorescently ישירות דוח העברת פריון כמו מוטציה אגרגטים Htt. חשוב מכך, הגישה שנתאר כאן יכול לשמש כדי לזהות גנים הרומן משעולים המתווכות התפשטות של אגרגטים חלבון בין סוגי תאים שונים vivo בתוך. מידע ממחקרים אלה ירחיב את ההבנה מוגבלת של המנגנונים פתוגניים אשר מושתתות מחלות ניווניות ולחשוף הזדמנויות חדשות התערבות טיפולית.
Introduction
ההשערה פריון נקבע כי הסוכן זיהומיות אחראי מדבקות spongiform encephalopathies (למשל, מחלת קרויצפלד – יעקב בבני אדם, scrapie כבשים, מחלה כרונית לבזבז צבאים, איילים, “מחלת הפרה המשוגעת” בבקר ) מורכב אך ורק של חלבון של חומצות גרעין1. מחלות פריון, החלבון פריון הסלולר (PrPC) ההנחה היא שנוצרה, יציב קיפול (PrPSc) מאוד בטא גיליון עשיר, באפשרותך להפיץ עצמית על ידי המרת וגיוס monomeric מולקולות PrPC לתוך עמילואיד יציב אגרגטים. PrPSc אגרגטים להשתמש במנגנון הזה המשכפלת להפיץ בין תאים שונים באורגניזם, אפילו בין אורגניזמים נפרדים2.
חלבון misfolding צבירת היא גם תכונה מרכזית של רוב מחלות ניווניות (מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), נוירודגנרטיביות (ALS))3. מערך הרכבות אינטרה – או תוספת – cellular מצטברים חלבונים במחלות אלה קשורה מאוד cytotoxicity4 ומתקדמת לאורך שבילים מאוד הדירים מחלות ספציפיות דרך המוח לאורך זמן5, 6. את הדפוסים הללו של התפשטות מציע כי אגרגטים פתוגניים הקשורים עם הפרעות אלה יש תכונות כמו פריון. כעת קיימת תמיכה חזקה כמו פריון שידור של אגרגטים הקשורים לספירה, PD, HD ו- ALS – הם מתפשטים מן-לתא ותבנית השינוי הסתגלותי של צורות monomeric של החלבון זהה של תאים בעבר לא מושפע7, 8.
הרוב המכריע של מחקרים חוקרת פריון כמו התפשטות אגרגטים חלבון עד כה בוצעו באמצעות מודלים בתרבית של תאים תרבות, איפה אגרגטים להעביר לתוך הציטופלסמה של תאים נאיביים מן המרחב חוץ-תאית או מתא אחר הציטופלסמה,9,10,11,12,13,14,15, או על ידי הזרקת חומר המכיל צבירה לתוך מוח העכבר וניטור צבירה המראה מחוץ הזרקת באתר16,17,18,19,20,21,22, 23. לאחרונה, חיות הטרנסגניים שימשו כדי להדגים אגרגטים תאיים התפשט לתאים אחרים בתוך המוח שלם24,25,26,27, 28,29,30. כאן, אנו מתארים שיטה עבור פריט חזותי ישיר של העברת הצבירה בין תאים בודדים במוח שלם של melanogaster דרוזופילה. דרוזופילה דגמי HD/polyglutamine (polyQ) מחלות פותחו לראשונה לפני כמעט שני עשורים31,32 , סיפקו הרבה תובנות המנגנונים פתוגניים העומדים בבסיס הפרעות אלה שלא יסולא בפז 33. HD הוא הפרעה ניווניות תורשתית הנגרמת על ידי מוטציה דומיננטי autosomal בגן כי הקודים חלבון huntingtin (Htt)34. מוטציה זו גורמת הרחבה של מתיחה polyQ ליד של Htt אמיני, מעבר לסף מסוים פתוגניים של ~ glutamines 37, גורם החלבון כדי misfold צבירה35,36. פראי-סוג Htt חלבונים המכילים < glutamines 37 ב מתיחה זו להשיג לקפל מקורית שלהם, אבל יכולה להיגרם כדי צבירה בעת מגע פיזי ישיר עם Htt צבירה "זרע"12,27,37. אנו מנצלים את זה homotypic, nucleated צבירה של Htt פראי-סוג כמו הבדיקה להעברה כמו פריון וכניסה cytoplasmic מוטציה האגרגטים Htt שמקורם בתאים אחרים.
קביעת מנגנוני על ידי אגרגטים פריון כמו איזה נסיעות בין תאים יכול להוביל הזיהוי של הרומן מטרות טיפוליות למחלות ניווניות חשוכות מרפא. אנחנו לוקחים את היתרון של מחזור חיי מהירה, קלות שימוש, ללקוחות שלנו גנטי של דרוזופילה melanogaster להגדרת מנגנונים מולקולריים-לתא התפשטות מוטציה אגרגטים Htt. האסטרטגיה שלנו ניסיוני מעסיקה שתי מערכות בינאריות ביטוי זמינה דרוזופילה, את ומבוססת Gal4 ספציפי נגד הזרם הפעלת רצף (Gal4-UAS) מערכת38 את פותח לאחרונה QF-QUAS מערכת39. זיווגים אלה שתי מערכות עצמאיות מאפשר הגבלת הביטוי של מוטציות ובני פראי-סוג transgenes Htt אוכלוסיות תאים נפרדים בתוך לטוס באותו ה40. באמצעות גישה זו, נבחן פריון כמו התפשטות של מוטציה Htt על-ידי ניטור הפצה מחדש של Htt פראי-סוג cytoplasmic ממצב שלה בדרך כלל ‘ מאטום לשקוף ‘, מסיסים למצב צבור, תוצאה ישירה של מגע פיזי עם מוטנט הקבועים מראש Htt צבירה “זרע”. המרה של פראי-סוג Htt מאת mutant Htt יכול להיות אישרו שימוש ביוכימי או טכניקות biophysical כי הדו ח אינטראקציות חלבון-חלבון, כגון קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה להעביר (סריג)9,27,41 .
חשוב, אנחנו יכולים גם לגשת מספר רב של כלים גנטיים דרוזופילה לזיהוי גנים ו/או מסלולים המתווכות פריון כמו התפשטות אגרגטים חלבון. השתמשנו לאחרונה בגישה זו כדי לחשוף את תפקיד מפתח עבור הקולטן נבלות פני שטח התא, דרייפר42,43, בהעברת אגרגטים Htt מוטציה של אקסונים עצביים בקרבת מקום עכשיו, phagocytic דונלד ב דרוזופילה המרכזית מערכת העצבים (CNS)27. לפיכך, הגישה הגנטית דימות מבוססות כי אנו מתארים כאן יכול לחשוף מידע חשוב ביולוגיים בסיסיים על תופעה מחלות רלוונטיות פשוטה לשימוש אבל אורגניזם מודל רב עוצמה, דרוזופילה.
Protocol
Representative Results
Discussion
המספרים של חולים הסובלים ממחלות ניווניות ממשיך לגדול, יש צורך דחוף להגדיל את ההבנה של פתוגנזה מולקולריים של מחלות אלו כך ניתן לפתח טיפולים טובים יותר. כאן, אנו מתארים שיטות המאפשרות לניטור פריון כמו שידור של אגרגטים חלבון פתוגניים בין סוגי תאים שונים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים חברים של מעבדות Kopito לואו, פירס דיונים מועילים רבים במהלך פיתוח שיטות אלה. אנו מודים גם בריאן Temsamrit לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מאוניברסיטת למדעים ונאמנויות צדקה של וו. סמית.
Materials
| Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
| Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
| 20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
| Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
| Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
| FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
| Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
| Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
| Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
| LAS X image analysis software | Leica | ||
| Imaris image analysis software | Bitplane |
Riferimenti
- Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
- Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting Proteostasis for Disease Intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
- Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease. Front Neurosci. 11, 64 (2017).
- Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
- Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
- Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases. Lancet Neurol. 16 (4), 323-332 (2017).
- Walker, L. C., Jucker, M. Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept. Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 3138-3147 (2013).
- Munch, C., O’Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
- Nonaka, T., et al. Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
- Ren, P. H., et al. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat Cell Biol. 11 (2), 219-225 (2009).
- Trevino, R. S., et al. Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface. J Biol Chem. 287 (35), 29722-29728 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Zeineddine, R., et al. SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation. Mol Neurodegener. 10, 57 (2015).
- Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O’Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways. Acta Neuropathol. 131 (1), 103-114 (2016).
- Clavaguera, F., et al. Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (23), 9535-9540 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer’s disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Eisele, Y. S., et al. Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12926-12931 (2009).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson’s disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (39), 5427-5433 (2015).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Liu, L., et al. Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo. PLoS One. 7 (2), 31302 (2012).
- Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nat Commun. 6, 6768 (2015).
- Pearce, M. M. Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease. Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).
- Pecho-Vrieseling, E., et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons. Nat Neurosci. 17 (8), 1064-1072 (2014).
- Wu, J. W., et al. Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo. Nat Neurosci. 19 (8), 1085-1092 (2016).
- Jackson, G. R., et al. Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons. Neuron. 21 (3), 633-642 (1998).
- Warrick, J. M., et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93 (6), 939-949 (1998).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetica. 201 (2), 377-402 (2015).
- The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15005 (2015).
- Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington’s disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
- Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity. J Mol Biol. 311 (1), 173-182 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Riabinina, O., Potter, C. J. The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila. Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).
- Costanzo, M., et al. Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes. J Cell Sci. 126 (16), 3678-3685 (2013).
- Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function. Neuron. 38 (4), 567-580 (2003).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
- Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images. BMC Bioinformatics. 9, 346 (2008).
- Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases. Acta Neuropathol. 134 (2), 187-205 (2017).
