Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Überwachung von Zelle zu Zelle Übertragung von Prion-wie Protein-Aggregate in Drosophila Melanogaster

Published: March 12, 2018

doi:

Kirby M. Donnelly, Margaret M. P. Pearce

¹Department of Biological Sciences,University of the Sciences

Summary

Beweise sammeln, unterstützt die Idee, dass Pathogene Protein-Aggregate im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen verteilt zwischen den Zellen mit Prion-ähnliche Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine Methode, die ermöglicht die Visualisierung von Zelle zu Zelle ausbreiten von Prion-ähnlichen Aggregaten im Modellorganismus Drosophila Melanogaster.

Abstract

Proteinaggregation ist ein zentrales Merkmal der meisten neurodegenerativen Krankheiten, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Protein-Aggregate sind eng verbunden mit Neuropathologie bei diesen Erkrankungen, obwohl der genaue Mechanismus, mit dem aberranten Proteinaggregation normale zelluläre Homöostase stört, nicht bekannt ist. Daten liefern starke Unterstützung für die Hypothese, dass Pathogene Aggregate in AD, PD, HD und ALS haben viele Ähnlichkeiten mit Prionen, die nur-Protein Krankheitserreger für den transmissiblen spongiformen Enzephalopathien verantwortlich sind. Prionen replizieren selbst von Template die Konvertierung nativ gefaltet Versionen des gleichen Proteins, Ausbreitung des Phänotyps Aggregation verursacht. Wie Prionen und Prion-ähnliche Proteine in AD, PD, HD und ALS Übergang von einer Zelle zur anderen ist derzeit eine Fläche von intensiver Untersuchung. Hier wird ein Drosophila Melanogaster -Modell, das erlaubt, Überwachung der Prion-Like, Zell-Zell-Übertragung von mutiertem Huntingtin (Htt) Aggregaten verbunden mit HD beschrieben. Dieses Modell nutzt die leistungsstarke Werkzeuge zur Manipulation der Transgene Ausdruck in vielen verschiedenen Geweben in Drosophila und nutzt ein Eindringmittel getaggt zytoplasmatischen Protein direkt Bericht Prion-artigen Übertragung von mutierten Htt-Aggregate. Wichtig ist, kann der Ansatz, den wir hier beschreiben, verwendet werden, identifizieren neue Gene und Wege, die Verbreitung von Proteinaggregaten zwischen unterschiedlichen Zelle Arten in Vivozu vermitteln. Erkenntnisse aus diesen Studien werden die begrenzte Verständnis der pathogenen Mechanismen erweitern, die neurodegenerativen Erkrankungen zu Grunde liegen und zeigen neue Möglichkeiten für eine therapeutische Intervention.

Introduction

Die Prion-Hypothese besagt, dass der Erreger verantwortlich für die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (z.B.Creutzfeldt – Jakob-Krankheit beim Menschen, Scrapie bei Schafen, verschwenden chronisch im Hirschen und Elchen und “Rinderwahnsinn” bei Rindern ) besteht ausschließlich aus Protein und frei von Nukleinsäuren¹. Prion-Krankheiten übernimmt die zellulären Prion-Protein (PrP^C) eine nicht-Native, stabile Falte (PrP-^Sc), die ist sehr Beta Blatt-reich und kann selbst durch die Umwandlung und Rekrutierung von Monomeren PrP^C Moleküle in stabilen Amyloid ausbreiten Aggregate. PrP-^Sc -Aggregate nutzen diesen selbstreplizierende Mechanismus zwischen verschiedenen Zellen in einem Organismus und sogar zwischen einzelnen Organismen²zu verbreiten.

Protein misfolding und Aggregation ist auch ein zentrales Merkmal der meisten neurodegenerativen Erkrankungen (Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS))³. Bildung von Intra oder extra zellulare aggregierten Protein Baugruppen bei diesen Erkrankungen ist eng verknüpft mit Zytotoxizität⁴ und schreitet hoch reproduzierbare und krankheitsspezifische Pfaden durch das Gehirn über Zeit⁵^, ⁶. diese Muster der Ausbreitung legen nahe, dass Pathogene Aggregate mit diesen Erkrankungen assoziiert sind Prion-ähnliche Eigenschaften haben. Starke Unterstützung existiert nun für Prion-wie Übertragung der Aggregate zugeordnete AD, PD, HD und ALS – sie breitete sich von Zelle zu Zelle und Vorlage der Konformationsänderung der Monomere Formen des gleichen Proteins in zuvor nicht betroffen Zellen⁷^, ⁸.

Die Mehrheit der Studien, die untersuchen Prion-artigen Ausbreitung von Proteinaggregaten bisher wurden durchgeführt mit Säugerzelle Kultur Modelle, bei denen ein Übergang Aggregate in das Zytoplasma der naive Zellen aus dem extrazellulären Raum oder von einer anderen Zelle Zytoplasma⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵, oder durch Einspritzen von Aggregat-haltigen Material in Mäusegehirnen und Überwachung aggregieren Auftritt außerhalb der Injektion Seite¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^, ²³. in jüngerer Zeit, transgene Tiere verwendet wurden, um nachzuweisen, dass die intrazelluläre Aggregate auf andere Zellen im intakten Gehirn²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^{, verbreiten} ²⁸^,²⁹^,³⁰. Hier beschreiben wir eine Methode für die direkte Visualisierung der aggregierten Transfer zwischen den einzelnen Zellen im intakten Gehirn von Drosophila Melanogaster. Drosophila -Modelle HD/Polyglutamin-(PolyQ) Krankheiten wurden vor fast zwei Jahrzehnten entwickelt³¹^,³² und haben viele wertvolle Einblicke in die pathogenen Mechanismen, die diese Störungen zugrunde liegen ³³. HD ist eine vererbte Neurodegenerative Erkrankung, verursacht durch eine autosomal dominante Mutation in dem gen, das für das Protein Huntingtin (Htt)³⁴kodiert. Diese Mutation führt zu Ausdehnung von einer PolyQ Strecke in der Nähe von Htts N-Terminus jenseits einer pathogenen Schwelle des ~ 37 Glutaminen, verursacht das Protein Misfold und insgesamt³⁵^,³⁶. Wildtyp Htt Proteine mit < 37 Glutaminen in diesem Küstenabschnitt erreichen ihre heimischen Herde, sondern induziert werden können, um aggregierte bei direktem Körperkontakt mit einer Htt Aggregat "seed"¹²^,²⁷^,³⁷. Wir nutzen diese homotypische kernhaltigen Aggregation von Wildtyp Htt als einer Anzeige für Prion-wie Transfer und zytoplasmatischen Eintrag von mutierten Htt-Aggregate mit Ursprung in anderen Zellen.

Bestimmung der Mechanismen durch die Prion-ähnliche Aggregate kann Reisen zwischen Zellen zur Identifizierung der neue therapeutische Targets für unheilbare Neurodegenerative Erkrankungen führen. Wir nutzen Sie den schnellen Lebenszyklus, Benutzerfreundlichkeit und genetische Lenkbarkeit von Drosophila Melanogaster , molekulare Mechanismen für die Zell-Zell-Ausbreitung von mutierten Htt Aggregate zu definieren. Unsere experimentelle Strategie beschäftigt zwei binäre Expressionssysteme in Drosophila, etablierten Gal4-spezifische vorgelagerten aktivierende Sequenz (Gal4-UAS) System³⁸ und vor kurzem entwickelt QF-QUAS System³⁹zur Verfügung. Diese zwei unabhängige Kupplungssysteme ermöglicht Ausdruck von Mutanten und Wildtyp Htt transgenen auf unterschiedliche Zellpopulationen innerhalb der gleichen fliegen⁴⁰zu beschränken. Mit diesem Ansatz untersuchen wir Prion-ähnliche Verbreitung der mutierte Htt durch Überwachung der Umverteilung der zytoplasmatischen Wildtyp Htt von seinem normalerweise diffuse, löslichen Zustand zu einem aggregierten Zustand, eine direkte Folge der Körperkontakt mit einer vorgeformten mutierte Htt aggregierte “Samen”. Umwandlung von Wildtyp Htt durch mutierte Htt kann bestätigt werden, mit biochemischen und biophysikalische Techniken, die berichten von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Fluoreszenz Resonanz Energie transfer (FRET)⁹^,²⁷^,⁴¹ .

Wichtig ist, greifen wir auch eine große Anzahl von genetischen Werkzeuge in Drosophila , Gene und/oder Wege, die Prion-artigen Ausbreitung von Proteinaggregaten vermitteln zu identifizieren. Wir haben vor kurzem dieser Ansatz verwendet, um eine Schlüsselrolle für die Zelle Oberfläche Scavenger Rezeptor, Draper⁴²^,⁴³, bei der Übertragung von mutierten Htt Aggregate von neuronalen Axone zum nahe gelegenen phagocytic Glia in Drosophila zentrale enthüllen Nervensystem (ZNS)²⁷. So kann die genetischen und Imaging-basierte Ansatz, den wir hier beschreiben wichtige biologische Basisinformationen über ein krankheitsrelevante Phänomen in der einfach zu bedienenden aber mächtige Modellorganismus Drosophilaoffenbaren.

Protocol

(1) Kupplung Gal4 – und QF-vermittelten Htt Transgene Ausdruck in Drosophila Sammeln und/oder transgenen Drosophila Melanogaster generieren Zeilen mit gewebespezifischen Gal4 oder QF “Treiber”, als auch Zeilen mit Wildtyp oder mutierte Htt-transgene stromabwärts des Gal4-UAS38 oder QF-QUAS39. Sicherzustellen Sie, dass die Proteine, die aus diesen transgene ausgedrückt sind verschmolzen, fluoreszierende Proteine oder Epitop-Tags ermöglichen ein…

Representative Results

Die hier beschriebenen Methoden produzieren robuste Daten, die zeigen Prion-artigen Übertragung von Proteinaggregaten Htt aus einer Zellpopulation zum anderen in der intakten Fliege CNS. Konvertierung von Wildtyp Htt von diffusen auf punktförmige wird durch direkte Fluoreszenz dieser YFP Schmelzverfahren Protein im Empfänger Glia infolge HttQ91 mCherry Ausdruck im Spender ORNs (Abbildung 2A-C und Abbildung 4<s…

Discussion

Da die Zahl der Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen weiter zu erhöhen, gibt es eine dringende Notwendigkeit, das Verständnis der molekularen Pathogenese dieser Erkrankungen erhöhen, so dass bessere Therapien entwickelt werden können. Hier beschreiben wir Methoden, die für die Überwachung der Prion-artigen Übertragung von pathogenen Proteinaggregaten zwischen verschiedenen Zelltypen in der Modellorganismus Drosophila Melanogaster. Wir haben vor kurzem diese Methode verwendet, um Prion-wie Getrieb…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Mitgliedern von Kopito, Luo und Pearce Labs für viele hilfreiche Diskussionen während der Entwicklung dieser Methoden. Wir danken auch Brian Temsamrit für kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Mittel von Universität der Wissenschaften und der w. Smith Stiftungen unterstützt.

Materials

Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	AM9625	Dilute to 1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes	Thomas Scientific	2904F24
20% paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filtered	Lampire Biological Laboratories	7332500	Aliquot and freeze upon receipt
Chicken anti-GFP	Aves Labs	GFP-1020	Use at 1:500 dilution
Rabbit anti-DsRed	Clontech	632496	Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain
FITC anti-chicken	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 568 anti-rabbit	Life Technologies	A11011	Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody	Life Technologies	A21235	Use at 1:250 dilution
Slowfade Gold Antifade Reagent	Life Technologies	S36936
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisher Scientific	12-550-143
Cover Glass (22 x 22 mm)	Globe Scientific	1404-15
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3	Ted Pella	503	use in non-dominant hand
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5	Ted Pella	505	use in dominant hand
LAS X image analysis software	Leica
Imaris image analysis software	Bitplane

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Citazione di questo articolo

Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P. Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (133), e56906, doi:10.3791/56906 (2018).