Génération simple d’une Culture de haut rendement de neurones induits des fibroblastes de la peau humaine adulte

Fibroblastes dermiques adultes ont été tirées des recherche de la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington cliniques au Centre John van Geest pour réparation du cerveau (Cambridge, UK) et servent sous approbation éthique locale (REC 09/H0311/88). Pour plus d’informations sur la procédure d’échantillonnage biopsie de peau, voir référence8. 1. préparation des fibroblastes de la peau pour la reprogrammation À l’aide d’une cellule automatisée dégel système ou un bain-marie à 37 ° C, décongeler les fibroblastes dermiques humains adultes (aHDFs) et blanc sur plaque de 200 000 par T75 flacon (comte avec un compteur de cellules automatisées) dans 10 mL de milieu de fibroblastes (voir tableau 1) à 37 ° C à 5 % de CO2. Effectuer un changement de moyen complet avec support de fibroblastes sur le lendemain. Changer le support de fibroblastes tous les 3 – 4 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence de 95 %.Remarque : Une fiole confluente contiendra environ 1 000 000 cellules. L’aHDFs peut être figé pour construire un stock d’une lignée cellulaire (section 2) ou un prêt directement re-plaqué de reprogrammation (section 3). 2. gel des fibroblastes de la peau Placer un récipient de congélation contrôlée-taux dans une boîte avec de la glace ou au réfrigérateur à 4 ° C. Dissocier les cellules avec 0,05 % de trypsine (1,5 mL par flacon T75) à 37 ° C pendant 3 à 5 min. Ajouter milieu de fibroblastes (contenant du sérum fœtal (SVF)) pour neutraliser la trypsine (3 mL par chasse par flacon T75) et recueillir les cellules individuelles dans un tube de 15 mL de débusquer les cellules dans le ballon deux fois. Compter les cellules à l’aide du compteur de cellules automatisées ; gel (recommandée) environ 500 000 aHDFs par flacon. Tournez en bas les cellules à 400 x g pendant 5 min. Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu de congélation (voir tableau 1) et le transfert dans le tube cryogénique. Placer les tubes directement dans le récipient de congélation contrôlée-taux. Stocker la vitesse contrôlée gel appareil à-80 ° C durant la nuit. Le lendemain, les tubes de transfert à un congélateur à-140 ° C et stocker jusqu’à ce que nécessaire. 3. placage de reprogrammation (jour −1) Remarque : Il est recommandé d’utiliser une couche de gélatine pour des expériences de courte durée (jusqu’à 30 jours) ; Alternativement, pour des expériences à long terme, il est recommandé de commencer sur les poly-L-ornithine, fibronectine et laminine (PFL) revêtement. 60 min avant le placage du aHDFs pour la reprogrammation, recouvrir une plaque 24 puits avec 0,1 % de gélatine (250 µL/puits) et incuber à 37 ° C. Aspirez le milieu des fibroblastes sur l’aHDFs. Laver une fois avec le SPD. Dissocier les cellules avec 0,05 % de trypsine (1,5 mL par flacon T75) à 37 ° C pendant 3 à 5 min. Ajouter moyen de fibroblastes pour neutraliser la trypsine (3 mL par chasse par flacon T75) et recueillir les cellules individuelles dans un tube de 15 mL de débusquer les cellules dans le ballon deux fois. Tournez en bas les cellules à 400 g pendant 5 min. jetez surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu de fibroblastes. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (pour assurer un contrôle de conversion de bonne qualité que la viabilité des cellules est supérieur à 90 % avec le bleu trypan Coloration). Pour une plaque complète de 24 puits, préparer une suspension de 1 320 000 cellules 13,2 mL de milieu de fibroblastes pour obtenir une suspension de 100 000 cellules/mL de milieu (ou 55 000 cellules/puits dans 550 µL de milieu de fibroblastes multiplié par le nombre de puits nécessaires). Aspirer la gélatine de la plaque et laver deux fois avec le SPD. Ajouter 500 µL de la suspension cellulaire dans chaque puits et incuber une nuit à 37 ° C à 5 % de CO2. 4. virale Transduction (jour 0) Remarque : Le travail avec Particules Lentivirales nécessite le matériel de catégorie 2 et de l’utilisation d’un agent à neutraliser le virus. Port doubles paires de gants est fortement recommandé. Chaude jusqu’à 13,2 mL de milieu de fibroblastes à 37 ° C. Décongeler un vecteur lentiviral contenant les facteurs de transcription, Ascl1 et Brn2 avec deux courtes hairpin RNAs (shARN) ciblage reste à température ambiante.Remarque : Se référer pour faire référence à8; la construction est disponible dans un dépôt de plasmide. Pour plus d’informations sur la procédure pour produire des lentivirus veuillez consulter référence9. Ajouter la quantité nécessaire de lentivirus à infecter l’aHDFs à la multiplicité d’infection (MOI) du 20 au milieu sans exhausteurs de transduction. Remplacer le milieu de la plaque 24 puits avec support de fibroblastes contenant le vecteur lentiviral (500 µL/puits) et incuber une nuit à 37 ° C à 5 % de CO2. Le lendemain, remplacer le support dans les puits avec support de fibroblastes frais sans le vecteur lentiviral.NOTE : Le support est considéré comme infectieux pendant 7 jours et à ce titre, une protection adéquate et des procédures de traitement doivent être utilisés pendant la première semaine suivant la transduction virale. 5. entretien des conversion des cellules Remarque : Une fois la conversion commence les cellules sont susceptibles d’être levée ; Prenez soin d’inclinez la plaque vers le haut et utiliser une pipette µL 1 000 quand supprimant media pour éviter les cellules détacher. Le jour 3, retirez le support de fibroblastes et ajouter 500 µL de milieu de conversion neuronale précoce (voir tableau 1). Deux à trois fois par semaine, retirer 225 µL de vieux moyen du puits et composant logiciel enfichable 250 µL de milieu frais de conversion neuronale précoce. Jour 18, enlever tous le milieu de chaque puits et remplacer avec 500 µL de milieu fin de conversion neuronale (voir tableau 1). Continuer à la moitié du milieu comme ci-dessus avec retard moyen de conversion neuronale changer tous les 2 – 3 jours jusqu’au jour 25 ou de point de terminaison experiment (Figure 1 a).Remarque : Si les cellules ne sont pas plaqués dans chaque puits pour l’expérience, remplir le puits vides avec PBS ou eau pour empêcher l’évaporation manifeste du milieu et de minimiser les variations entre les puits. Concentration de stock Travail de Concentration Moyen de fibroblastes Milieu de base N/A N/A La pénicilline/streptomycine 10 000 U/mL 100 mg/mL FBS N/A 10 % Point de congélation moyen Moyen de fibroblastes N/A 45 % FBS N/A 45 % DMSO N/A 10 % Moyen de conversion neuronale précoce (ENM) Moyen de différenciation neurale N/A N/A La pénicilline/streptomycine 10 000 U/mL 100 mg/mL CHIR99021 10 mM 2 ΜM SB-431542 20 mM 10 ΜM Caboche 100 µg/mL 0,5 µg/mL LDN-1931189 10 mM 0,5 ΜM APV 1 M 1 mM LM-22A4 20 mM 2 ΜM GDNF 20 µg/mL 2 ng/mL NT3 10 µg/mL 10 ng/µL DB-cAMP 50 mM 0,5 mM Retard moyen de conversion neuronale (LNM) Moyen de différenciation neurale N/A N/A La pénicilline/streptomycine 10 000 U/mL 100 mg/mL LM-22A4 20 mM 2 ΜM GDNF 20 µg/mL 2 ng/mL NT3 10 µg/mL 10 ng/µL DB-cAMP 50 mM 0,5 mM Tampon de FACS HBSS 1 x [- calcium, magnésium, – rouge de phénol] N/A N/A BSA N/A 1 % DNAase N/A 0.05 % Tableau 1 : Composition des différents médias utilisés. Description complète de la composition pour tous les supports nécessaires dans le présent protocole, y compris les moyennes des fibroblastes, congélation moyen, moyen de conversion neuronale précoce, tardive conversion neuronale moyen et tampon de FACS. 6. verre couvre-objet pour les enregistrements électrophysiologiques Remarque : Il est recommandé de porter une blouse, lunettes, double gants et terminer tous les travaux dans une hotte de laboratoire. Ce protocole est adapté à partir de 10. Placez les lamelles de verre au fond d’un plat en verre sans chevauchement. Ajouter lab général nettoyage détergent pour submerger tous les lamelles sans risquer de trop plein au cours de l’agitation (environ 30 mL). Placer sur un agitateur orbital à vitesse lente pendant 2 h. Lavez six fois (30 min chacun) avec de l’eau désionisée autoclavé. Ajouter de l’éthanol à 95 % pendant 2 h. Enlever l’éthanol et attendre jusqu’à ce que les lamelles soient secs. Une fois sec, transférer les lamelles dans un bécher en verre et ajouter 70 % d’acide nitrique, jusqu’à ce que les lamelles soient submergés. Placer le bécher en verre dans un bain sonicateur pendant 60 min. Retirer l’acide nitrique et laver trois fois avec de l’eau désionisée autoclavé.ATTENTION : Toujours ajouter l’acide à l’eau, jamais l’inverse car cela peut entraîner une réaction violente. Supprimer autant d’eau du bécher possible et ajouter l’acide chlorhydrique concentré (HCI) jusqu’à ce que les lamelles soient submergés ; agiter le bécher et couvrir avec le film de paraffine. Laisser agir pendant 60 min (50 – 60 Hz, 30 W). Enlever autant HCI à lamelles que possible et de la place dans une poubelle appropriée. Rincez à l’eau désionisée autoclavé deux fois. Prenez les lamelles sur le capot et rincer 20 fois (ou plus) avec de l’eau désionisée autoclavable jusqu’à ce que toute la HCI est supprimée. Une fois sec, placer les lamelles dans stériles plaques 24 puits. Placer les plaques sous les rayons ultraviolets (UV) lumière du jour au lendemain. Le lendemain, les lamelles sont prêts à l’emploi.Remarque : Si le couvre-objet en verre est utilisés, il est recommandé d’utiliser l’enduit de PFL. Il suffit de placer une lamelle couvre-objet dans chaque puits d’une plaque de 24 puits (à l’aide de la pince stérile) et suivre le protocole ci-dessous. 7. PFL revêtement pour la Culture à Long terme Recouvrir la plaque 24 puits avec poly-L-ornithine (500 µL/puits) et laisser une nuit à 37 ° C à 5 % de CO2. Aspirer la poly-L-ornithine et attendez qu’il soit assez sèche pour former des gouttes sur le dessus. Faire une goutte (environ 60 µL) de laminine dans le centre de chaque bien et réparties pour couvrir toute la surface de la lamelle. Laissez pendant 2 h 45 min à 37 ° C à 5 % de CO2. Laver trois fois avec le SPD. Ajouter la fibronectine (500 µL/puits) et laisser une nuit à 37 ° C à 5 % de CO2. Laver une fois avec le SPD, avant d’ajouter les cellules.Remarque : Le revêtement de la PFL peut être utilisé pour le long terme cultures des iNs (plus de 100 jours), bien que la mort cellulaire progressive doit être prévu de 30 jours. 8. FACS Remarque : Pour re-plaque les cellules après FACS tri préparer une plaque de revêtement PFL 48 h à l’avance. Les cellules peuvent être triés à l’aide d’un anticorps de molécule (NCAM) adhérence de cellules neurales de jour 20 partir suite de transduction. Retirez le support avec une pipette 1 000 µL (ne pas laver pour éviter le détachement des cellules). Ajouter cellule dissociant agent (250 µL/puits), laisser pendant 10 à 20 min jusqu’à la levée de cellules et le flotteur en cellules individuelles. Pendant ce temps préparer le tampon de FACS. Triturer doucement avec une pipette 1 000 µL. Si quelques massifs restent, Incuber un peu plus. Après avoir obtenu une suspension monocellulaire, retirez-le du puits et placer dans un tube de 1,5 mL. Débusquer le puits deux fois fin moyen de conversion neuronale et les placer dans le même tube de 1,5 mL. Tournez en bas à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 200 µL de tampon de FACS. Tournez en bas les cellules à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Répétez les étapes 8.8 et 8.9 deux fois. Resuspendre le culot dans 50 µL de tampon de FACS contenant des anticorps humain de CD56 (NCAM) à une concentration de 01:50 pendant 15 minutes sur la glace. Protéger de la lumière. Tournez en bas les cellules à 400 x g pendant 5 min. Resuspendre dans 200 µL de tampon de FACS pour laver et essorer les cellules à 400 g pendant 5 min. Répétez l’étape 8.13. Resuspendre dans 200 µL de tampon de FACS contenant de l’iodure de propidium (PI ; 10 µg/mL). Trier les NCAM positive (iNs) et les PI négatif () des cellules vivantes à l’aide de FACS de blocage basée sur le niveau d’intensité de fluorescence des échantillons témoins qui ne sont pas colorés avec les anticorps de la NCAM ou PI. Recueillir les cellules positives NCAM dans un tube contenant le support fin de conversion neuronale. Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisées et re-plaque les cellules à une densité élevée (50 000 cellules/cm2) dans un milieu neuronal conversion tardive dans un plat recouvert de PFL. Continuent de changer la moitié de la moyenne 2 à 3 fois par semaine avec moyen de conversion neuronale fin jusqu’à ce que le point de terminaison experiment (Figure 1 a).