Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Volwassen dermale fibroblasten verkregen is van het onderzoek van de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington klinieken in het centrum van John van Geest voor hersenen reparatie (Cambridge, UK) en onder lokale ethische goedkeuring (09/H0311/88 van de REC) gebruikt. Zie voor meer informatie over de huid biopsie weergegeven monstertrekkingsprocedure, verwijzing8. 1. voorbereiding van de huid fibroblasten herprogrammering Met behulp van een geautomatiseerde cel ontdooien systeem of een waterbad 37 ° C, ontdooien van de volwassen menselijke dermale fibroblasten (aHDFs) en plaat van 200.000 per T75 kolf (count en voorzien van een geautomatiseerde cel teller) in 10 mL fibroblast voedingsbodem (Zie tabel 1) bij 37 ° C in 5% CO2. Voer een volledige middellange verandering met fibroblast medium op de volgende dag. Het medium van de fibroblast elke 3-4 dagen de cellen tot 95% confluentie wijzigen.Opmerking: Één confluente kolf zal ongeveer 1.000.000 cellen bevatten. De aHDFs kan worden bevroren om te bouwen van een voorraad van de cellijn (sectie 2) of direct opnieuw vergulde klaar voor herprogrammering (sectie 3). 2. de bevriezing van de huid fibroblasten Plaats van een gecontroleerde-tarief bevriezing container in een doos met ijs of in de koelkast bij 4 ° C. Distantiëren van de cellen met 0,05% trypsine (1,5 mL per T75 kolf) bij 37 ° C gedurende 3-5 min. Fibroblast opslagmedium (met foetale runderserum (FBS)) te neutraliseren de trypsine (3 mL per spoeling per T75 kolf) en het verzamelen van de vrijstaande cellen in een tube van 15 mL door te spoelen uit de cellen in de kolf tweemaal toevoegen. Met behulp van de geautomatiseerde cel counter; cellen tellen (aanbevolen) bevriezing ongeveer 500.000 aHDFs per flacon. Spin down de cellen bij 400 x g gedurende 5 min. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL van bevriezing medium (Zie tabel 1) en overdracht in de cryogene buis. De buizen direct in de gecontroleerde-tarief bevriezing container plaatsen. Bewaar het gecontroleerde percentage bevriezing apparatuur op-80 ° C’s nachts. De volgende dag, de buizen overbrengen in een vriezer-140 ° C en op te slaan totdat het nodig is. 3. plating voor herprogrammering (dag-1) Opmerking: Het is aanbevolen om gebruik van een coating van gelatine voor korte termijn experimenten (maximaal 30 dagen); Als alternatief voor de lange termijn experimenten verdient het om te beginnen op een poly-L-ornithine, fibronectin en laminin (PFL) coating. 60 min voordat plating de aHDFs voor herprogrammering, een 24-well plaat met 0,1% gelatine (250 µL per putje) jas en Incubeer bij 37 ° C. Het medium van de fibroblast op de aHDFs gecombineerd. Een keer wassen met DPBS. Distantiëren van de cellen met 0,05% trypsine (1,5 mL per T75 kolf) bij 37 ° C gedurende 3-5 min. Fibroblast medium om te neutraliseren de trypsine (3 mL per spoeling per T75 kolf) en het verzamelen van de vrijstaande cellen in een tube van 15 mL door te spoelen uit de cellen in de kolf tweemaal toevoegen. Spin down de cellen bij 400 x g gedurende 5 min. Discard supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL fibroblast voedingsbodem. Met behulp van een geautomatiseerde cel prestatiemeteritem (zorgen voor een goede conversie kwaliteitscontrole die de levensvatbaarheid van de cellen is boven de 90% met trypan blauw kleuring) cellen tellen. Voor een volledige 24-well plaat, maak een suspensie van 1,320,000 cellen in 13.2 mL fibroblast voedingsbodem om een opschorting van 100.000 cellen/mL medium (of 55.000 cellen per putje in 550 µL van fibroblast medium vermenigvuldigd met het aantal putten nodig). Gecombineerd de gelatine van de plaat en spoel tweemaal met DPBS. Voeg 500 µL van de celsuspensie aan elk putje en na een nacht bebroeden bij 37 ° C in 5% CO2. 4. virale transductie (dag 0) Opmerking: Werken met lentivirale deeltjes vereist categorie 2-apparatuur en het gebruik van een agent om te neutraliseren het virus. Het dragen van dubbele paren van handschoenen is ook sterk aangeraden. Opwarmen 13.2 milliliters fibroblast middellange tot 37 ° C. Een lentivirale vector met de transcriptiefactoren, Ascl1 en Brn2 met twee korte haarspeld RNAs (shRNA) REST targeting op kamertemperatuur ontdooien.Opmerking: Verwijzen als u verwijst naar8; de constructie is beschikbaar in een plasmide repository. Raadpleeg voor meer informatie over de procedure voor het produceren van lentivirussen verwijzen naar9. Voeg de nodige hoeveelheid lentivirus te infecteren de aHDFs op de veelheid van infectie (MOI) van 20 aan het medium zonder elk transductie versterkers. Vervang het medium in de 24-well plaat met fibroblast medium dat het lentivirale vector (500 µL per putje) en na een nacht bebroeden bij 37 ° C in 5% CO2. De volgende dag, wordt het medium in de putjes vervangen door verse fibroblast medium zonder de lentivirale vector.Opmerking: Het medium wordt beschouwd als besmettelijk voor 7 dagen en als zodanig, adequate bescherming en veilige omgang tijdens de eerste week na virale transductie moeten worden gebruikt. 5. onderhoud van de omzetten cellen Opmerking: Zodra de conversie begint de cellen zijn gevoelig voor opheffing; Zorg voor het uiteinde van de plaat omhoog en een 1.000 µL pipet gebruiken bij het verwijderen van media om te voorkomen dat cellen loskoppelen. Op dag 3, verwijder het medium van de fibroblast en voeg 500 µL van vroege neuronale conversie medium (Zie tabel 1). Twee tot drie keer per week, neem 225 µL van een oud medium uit de put en invoegtoepassing 250 µL van verse vroege neuronale conversie medium. Op dag 18, verwijdert u alle van het medium uit elk putje en vervangen 500 µL van late neuronale conversie medium (Zie tabel 1). Blijven de helft van het medium als hierboven met late neuronale conversie medium veranderen elke 2-3 dagen tot de dag 25 of experiment eindpunt (figuur 1A).Opmerking: Als cellen zijn niet verguld in elke put voor het experiment, vullen lege putten met PBS of water ter voorkoming van openlijke verdamping van het medium en het minimaliseren van de variatie tussen putten. Voorraad concentratie Werken concentratie Fibroblast medium Basaal medium N/B N/B Penicilline/streptomycine 10.000 U/mL 100 mg/mL FBS N/B 10% Bevriezing van medium Fibroblast medium N/B 45% FBS N/B 45% DMSO N/B 10% Vroege neuronale conversie medium (ENM) Neurale differentiatie medium N/B N/B Penicilline/streptomycine 10.000 U/mL 100 mg/mL CHIR99021 10 mM 2 ΜM SB-431542 20 mM 10 ΜM Bekertje 100 µg/mL 0,5 µg Mo/mL LDN-1931189 10 mM 0,5 ΜM VPA 1 M 1 mM LM-22A4 20 mM 2 ΜM GDNF 20 µg Mo/mL 2 ng/mL NT3 10 µg Mo/mL 10 ng/µL DB-cAMP 50 mM 0.5 mM Laat neuronale conversie medium (LNM) Neurale differentiatie medium N/B N/B Penicilline/streptomycine 10.000 U/mL 100 mg/mL LM-22A4 20 mM 2 ΜM GDNF 20 µg Mo/mL 2 ng/mL NT3 10 µg Mo/mL 10 ng/µL DB-cAMP 50 mM 0.5 mM FACS Buffer HBSS 1 x [- calcium, magnesium, – fenol rood] N/B N/B BSA N/B 1% DNAase N/B 0,05% Tabel 1: samenstelling van de verschillende gebruikte media. Volledige beschrijving van de compositie voor alle media in dit protocol, met inbegrip van de fibroblast medium, bevriezing van medium, vroege neuronale conversie medium, laat neuronale conversie medium en FACS buffer nodig. 6. glas Coverslips voor elektrofysiologische opnamen Opmerking: Het is aanbevolen om een laboratoriumjas, bril dragen, dubbele handschoenen, en al het werk in een zuurkast te voltooien. Dit protocol is aangepast van 10. Plaats glas coverslips bij de bodem van een glazen schotel zonder elkaar overlappen. Voeg algemene lab schoonmaken wasmiddel te dompelen aller de coverslips zonder riskeren overloop tijdens het schudden (ongeveer 30 mL). Plaats op een roteerschudapparaat op lage snelheid gedurende 2 uur. Wassen zesmaal (elke 30 min) met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water. Toevoegen van 95% ethanol voor 2 h. Verwijder de ethanol en wachten tot coverslips droog zijn. Eenmaal droog, de coverslips Breng in een bekerglas van glas en 70% salpeterzuur toevoegen totdat de coverslips zijn ondergedompeld. Plaats het bekerglas van glas in een ultrasoonapparaat bad voor 60 min. Verwijder de salpeterzuur en spoel driemaal met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water.Let op: Altijd toevoegen zuur aan water, nooit andersom omdat dit tot een gewelddadige reactie leiden kan. Verwijder zo veel water uit het bekerglas mogelijk en geconcentreerd zoutzuur (HCI) totdat de coverslips zijn ondergedompeld; Swirl het bekerglas en dek met paraffine film. Bewerk ultrasone trillingen ten voor 60 min (50-60 Hz, 30 W). Verwijder zoveel HCI uit coverslips mogelijk en plaats in een geschikte afval opslaglocatie. Spoel tweemaal met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water. Neem de coverslips uit de motorkap en 20 keer (of meer) met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water spoelen, totdat alle van de HCI is verwijderd. Eenmaal droog, coverslips plaats in steriele 24-Wells-platen. Plaats de platen onder ultraviolet (UV) licht ‘s nachts. De volgende dag de coverslips zijn klaar voor gebruik.Opmerking: Als glas coverslips worden gebruikt, is het aanbevolen om het gebruik van de PFL-coating. Gewoon een dekglaasje aan plaats in elk putje van de plaat van een 24-well (met behulp van steriele verlostang) en volg het protocol zoals hieronder. 7. PFL Coating voor lange termijn cultuur De 24-well plaat met poly-L-ornithine (500 µL per putje) jas en laat ‘s nachts bij 37 ° C in 5% CO2. Gecombineerd de poly-L-ornithine en wacht tot het droog genoeg aan formulier druppels op bovenkant is. Maak een druppel (ongeveer 60 µL) laminin in het midden van elk goed en verspreid ter dekking van het hele oppervlak van het dekglaasje aan. Laat gedurende 2 h 45 minuten bij 37 ° C in 5% CO2. Spoel driemaal met DPBS. Voeg fibronectine (500 µL per putje) en laat ‘s nachts bij 37 ° C in 5% CO2. Een keer wassen met DPBS voordat u cellen toevoegt.Opmerking: De PFL coating kan worden gebruikt voor de lange termijn culturen van iNs (meer dan 100 dagen), hoewel progressieve celdood is naar verwachting vanaf dag 30. 8. FACS Opmerking: Om opnieuw de cellen plaat na FACS sorteren bereiden een PFL beklede plaat 48u op voorhand. Cellen kunnen worden gesorteerd met behulp van een antilichaam neurale cel adhesie molecuul (NCAM) vanaf dag 20 vanaf na transductie. Verwijder het medium met een 1.000 µL Pipet (niet wassen om te voorkomen dat cellen los). Cel distantiëren van de agent (250 µL per putje) toevoegen, laat gedurende 10-20 minuten totdat de cellen lift, en zweven als afzonderlijke cellen. Gedurende deze tijd de FACS buffer te bereiden. Triturate voorzichtig met een 1.000 µL pipet. Als sommige bosjes blijven, incubeer een beetje langer. Zodra een eencellige opschorting is verkregen, verwijderen uit de put en plaatsen in een 1,5 mL-buis. Spoelen uit de put tweemaal met late neuronale conversie medium en plaats in de dezelfde 1,5 mL-buis. Spin down bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 200 µL van FACS buffer. Spin down de cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Herhaal stap 8,8 en 8,9 tweemaal. Resuspendeer de pellet cel in 50 µL van FACS buffer met menselijke CD56 (NCAM) antilichaam bij een concentratie van 1:50 gedurende 15 minuten op het ijs. Beschermen tegen licht. Spin down de cellen bij 400 x g gedurende 5 min. Resuspendeer in 200 µL FACS buffer te wassen en spin down de cellen bij 400 x g gedurende 5 min. Herhaal stap 8.13. Resuspendeer in 200 µL van FACS buffer met propidium jodide (PI; 10 µg/mL). Sorteren de NCAM-positieve (iNs) en negatieve (live) cellen PI FACS via gating op basis van de fluorescentie intensiteitsniveau controlemonsters die waren niet gekleurd met de NCAM antilichaam of PI. Verzamelen van de NCAM-positieve cellen in een buis met late neuronale conversie medium. De cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller en opnieuw plaat de cellen bij een hoge dichtheid (50.000 cellen/cm2) tellen in late neuronale conversie medium in een schotel PFL bekleed. Blijven veranderen de helft van het medium 2 tot 3 keer per week met late neuronale conversie medium tot het experiment eindpunt (figuur 1A).