Cuantificación de endógeno auxina y citoquinina durante cultura de entrenudo de Ipecacuana
Summary
Brotes adventicios pueden ser inducidas en los segmentos internodales de Ipecacuana sin tratamiento de fitohormonas. Para evaluar la dinámica de la fitohormona durante la formación de brotes adventicios, medimos endógeno auxina y citocinina en segmentos internodales por LC-MS/MS.
Abstract
Formación de brotes adventicios es una técnica importante para la propagación de cultivos de importancia económica y para la regeneración de plantas transgénicas. Tratamiento de fitohormonas se requiere para la inducción de brotes adventicios en la mayoría de las especies. Si se pueden inducir brotes adventicios se determina por el balance entre auxinas y citoquininas (CK) niveles. Mucho esfuerzo se va a determinar concentraciones óptimas y combinaciones de fitohormonas en cada tejido utilizado como explantes y en cada especie de planta. En jarabe de Ipecacuana, sin embargo, brotes adventicios se pueden inducir en los segmentos internodales en medio de cultivo sin tratamiento de fitohormonas. Esto permite la plasticidad inherente del jarabe de ipecacuana para la diferenciación de la célula ser evaluados. Para inducir brotes adventicios en el jarabe de Ipecacuana, nos cultiva segmentos internodales a 24 ° C con 15 μmol m−2 s−1 de la luz en un ciclo oscuro de 14 h luz/10-h en medio de B5 sin fitohormonas solidificado con la goma de gellan 0.2% durante 5 semanas. Para investigar la dinámica de la fitohormona durante la formación de brotes adventicios, medimos endógeno ácido indol-3-acético y CKs en los segmentos por líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas LC-MS/MS. Este método permite el análisis de ácido indol-3-acético endógeno y CKs de una manera sencilla. Puede ser aplicado para investigar la dinámica de la auxina endógena y CK durante la organogénesis en otras especies vegetales.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propuso el concepto de “totipotencia”, por que las plantas las células pueden dividir, diferenciar y regenerar plantas enteras incluso después de su previa diferenciación en tipos celulares específicos en plantas maduras1. En cultivo de tejidos, si la regeneración de plantas puede ser inducida o no se determina por la combinación y concentración de fitohormonas exógeno aplicados en el medio de crecimiento. Skoog y Miller encontraron que se podían inducir brotes adventicios de callo de tabaco en el medio de cultivo que contiene una alta proporción de CKs a auxinas, mientras que se podían inducir raíces adventicias en medio que contiene una proporción baja de2. Desde aquel hallazgo, cultivo de tejidos ha sido ampliamente utilizado para la propagación de cultivos de importancia económica y para la regeneración de plantas transgénicas3. Pueden inducir brotes adventicios de tejidos que no sean de meristemo apical de brote, como hojas, raíces y entrenudos. Se requiere para la inducción de brotes adventicios en la mayoría de especies de plantas tratamiento de fitohormonas. Sin embargo, las concentraciones óptimas y combinaciones diferencian por especie y tejido utilizado como explantes. Por lo tanto, mucho esfuerzo va a determinar las concentraciones óptimas y combinaciones de fitohormonas para experimentos.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Ipecacuana) es una planta medicinal que contiene alcaloides como la emetina y la cefalina, principalmente en las raíces4. Extractos de la raíz se utilizan como expectorante, emético y un amoebicide5. Aunque Ipecacuana crece naturalmente en las selvas tropicales de Brasil, es reacio a establecer las semillas en la cultura, y la tasa de germinación disminuye durante el almacenamiento de la semilla en Japón, con su frío clima6. En cambio, se propaga por cultivo de tejidos, en adventicias que dispara la formación de entrenudos es el método más eficiente7,8. Curiosamente, se pueden inducir brotes adventicios en esta especie sin fitohormonas tratamiento8.
Brotes adventicios se forman en la epidermis de la región apical de los segmentos internodales sin callusing, pero no en la región basal9. Esta diferencia indica polaridad de tejido en los segmentos internodales, que es probablemente bajo Reglamento fitohormonal. El sistema de cultivo de jarabe de Ipecacuana permite una oportunidad única para analizar cambios en los niveles de fitohormonas endógenas durante la formación de brotes adventicios. Aquí presentamos nuestro método para el análisis de los niveles endógenos de una auxina (ácido indol-3-acético (AIA)) y cuatro CKs (isopentenyl adenina (iP), isopentenyl adenina riboside (iPR), trans-zeatina (tZ) y trans-riboside zeatina (tZR)) en los segmentos internodales mediante LC-MS/MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para identificar la distribución de fitohormonas en la organogénesis, es importante utilizar materiales de la planta en la que puede observarse en medio libre de fitohormonas, organogénesis porque cuando fitohormonas exógeno se aplican a los explantes para la inducción de brotes o raíces, afectan el explante entero, lo que hace difícil evaluar la plasticidad inherente de las plantas en la diferenciación celular y organogénesis. Brotes adventicios pueden ser inducidos en medios de cultivo libres de fitohormonas e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Sr. Akira Murakami del Departamento de Biociencias Aplicadas, la Universidad de Toyo y el Sr. Koudai Taniguchi del centro de tecnología agrícola de Gunma su asistencia técnica. Agradecemos también al profesor Shosaku Kashiwada y Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Universidad de Toyo por sus sugerencias. Este estudio fue apoyado en parte por el centro de investigación para la vida y ciencias ambientales, Universidad de Toyo.
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
Riferimenti
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
