JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Типовых скрининг метод для микрочастиц в трансфузии тромбоцитов

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56893
, , ,
1Research & Development,LightIntegra Technology Inc., 2Quality Engineering & Regulatory,LightIntegra Technology Inc., 3Department of Pathology and Laboratory Medicine; Center for Blood Research,University of British Columbia, 4Canadian Blood Services

Summary

Управление запасами тромбоцитов, основанные на скрининг микрочастица содержание в концентраты тромбоцитов — это новая инициатива улучшения качества в банках крови больницы. Цель заключается в дифференцировать активированные из неактивированные тромбоциты для оптимизации использования тромбоцитов. Предоставление неактивированные тромбоцитов больных гематологии онкологии может уменьшить их высоким риском стать огнеупорные.

Abstract

Управление запасами тромбоцитов, основанные на скрининг микрочастица содержание в концентраты тромбоцитов является новой инициативой улучшения качества для банков крови больницы. Клетки фрагмент от микрочастиц (МП), когда они подчеркнули. Компоненты крови и крови может содержать клеточных фрагментов из различных клеток, прежде всего из активированных тромбоцитов. При выполнении их роли как врожденные иммунные клетки и основных игроков в коагуляции и гемостаз, тромбоциты изменить форму и генерировать микрочастицы. С Динамическое рассеяние света (DLS)-на основе обнаружения микрочастица, это позволяет дифференцировать активированные (высокая тонкодисперсный) от неактивированные (низкая тонкодисперсный) тромбоцитов в переливании и оптимизации использования дефицитных крови продукта. Предыдущие исследования показывают, что предоставление неактивированные тромбоциты для профилактического использования в гематологии онкологии больных может уменьшить их риск стать огнеупорных и улучшения ухода за пациентами. Цель этого метода скрининга является регулярно дифференцировать активирован неактивированные тромбоцитов. Метод, описанный здесь описываются шаги необходимо выполнить для управления запасами обычных тромбоцитов в банке крови больницы: получение образца от переливания тромбоцитов, загрузки образца в капилляр для измерения DLS, выполняя DLS тест идентифицировать микрочастицы и с использованием сообщил микрочастица содержимого для идентификации активированных тромбоцитов.

Introduction

Интерес к микрочастицы вращалась главным образом вокруг их участие в ячейки к ячейке коммуникации и биологических процессах. 1 , 2 , 3 совсем недавно, микрочастицы также привлекли интерес как потенциальных ранних диагностических маркеров аутоиммунных и сердечно-сосудистых заболеваний. 4 , 5 микрочастицы, также известный как внеклеточного везикулы или exosomes, были широко изучены проточной цитометрии. К сожалению несмотря на попытки унифицировать цитометрии обычного потока существует консенсус на протоколе оптимального использования. 6 , 7 , 8 , 9 , 10

Хотя обычной проточной цитометрии можно охарактеризовать конкретные MP субпопуляций,11 , он имеет несколько сообщили ограничения. 11 , 12 , 13 , 14 некоторые из этих ограничений были рассмотрены с использованием более высокой мощности лазеров и детекторы в так называемый «мелкие частицы вариант»,15,16 , а также обнаружения на 15-25 ° вперед разброс угол и изменение давления оболочка . 17 , 18 тем не менее, метод быстрый и easy-to-use скрининга, который могут быть объединены с этим сложные методы по-прежнему необходимо использовать микрочастицы как ранних диагностических маркеров. Повышенные уровни микрочастиц обнаруживаются примерно в одной трети из нормальной крови доноров19 и указывать субклинической условий. Следовательно уровни высокой микрочастица в донорской крови продуктов могут быть несовместимы с уязвимых получателей. 20

При предоставлении Трансфузии тромбоцитов, существует риск неиммунизированных огнестойкости – условие которой тело пациента отвергает подряд переливаний и не допускает значительную часть тромбоцитов распространить. 21 , 22 номера иммунной огнеупорность может привести к впустую переливаний, остается осложнения здоровья для пациентов и расширенном больницу. 23 Трансфузии тромбоцитов, содержащие большое количество микрочастиц может быть фактором для развития неиммунизированных огнеупорность в уязвимых гематологии онкологии больных. 20 это возможность управлять тромбоцитов инвентаризации по составу Трансфузии тромбоцитов, скрининг на микрочастицы, снижая тем самым риск для уязвимых пациентов. Однако, большинство микрочастица тестов требуют изоляции микрочастицы из тромбоцитов5,12 или иным образом весьма труда курс Интенсив24,25 и поэтому не могут быть реализованы регулярно в больнице банков крови.

Метод, описанный здесь использует Динамическое рассеяние света (DLS) – также известный как спектроскопии корреляции фотонов или квази упругого рассеяния света. На протяжении десятилетий Динамическое рассеяние света широко используются в фармацевтической промышленности для характеристики препарата липосомального формулировок или эмульсии где размеры частиц находятся в диапазоне от субмикронных. 26 , 27 однако, инструменты, разработанные для этих приложений не оптимизированы для экрана продуктов крови. Была разработана новая система DLS преодолеть технические ограничения и сделать полезным для скрининга Трансфузии тромбоцитов динамического рассеяния света. 28

Динамическое рассеяние света измерения выполняются, освещающие взвешенных частиц с лазерного света и анализируя время вариации интенсивности рассеянного света, который является следствием частиц, движущихся в суспензии. Кроме того этот метод использует обратная связь между скорости частицы и размер – мелкие частицы двигают быстро и крупных частиц двигаться медленно – предоставлять информацию о распределением размера и относительной концентрации компонентов образца. С помощью DLS, среднее микрочастица контента и средний радиус микрочастица компонента могут быть количественно. Содержание микрочастиц в крови продукт дается как % МП, основанный на площади в измеренные гистограмму для частицы радиусом 50-550 Нм. В то время как частицы с радиусами ниже 50 Нм обнаружены DLS и сообщенное системой DLS, они не включаются в % MP. Вместо того, чтобы изолировать микрочастицы из тромбоцитов, неоднородность Трансфузии тромбоцитов определяется на основании относительное содержание микрочастиц и тромбоцитов в образце. В самом деле соотношения тромбоцитов и тонкодисперсный пиков может использоваться для расчета абсолютной концентрации MP, когда известно количество тромбоцитов. 19

Система DLS обеспечивает работников здравоохранения с качественной и количественной информации о микрочастиц в образцах, полученных из человеческой крови или продуктов крови. Основным преимуществом метода описаны DLS над альтернативные методы, такие как проточной цитометрии, электронная микроскопия,29 наночастиц отслеживания анализа30 или перестраиваемый резистивный пульс зондирования31 является подготовка образца: аликвоты концентраты тромбоцитов может измеряться непосредственно без необходимости изолировать депутат от тромбоцитов, разбавления образца или другие изменения. 9 , 17 в дополнение, DLS является абсолютной калибровке методом и не страдает от недостатка калибровки бусины с соответствующим показателем преломления. 14 , 32

Корреляция между активации тромбоцитов и MP содержание ранее показывает микроскопии33,20 и может быть выведен из увеличение содержания MP в патологических условиях15,34, 35 , 36 и в vitro условиях известно для активации тромбоцитов. 19 , 37 , 38 однако, далее необходимы исследования в полной мере понять отношения DLS-измеряется микрочастица содержание и тромбоцитов активации. Основываясь на наших текущих знаний активированных тромбоцитов содержат большое количество микрочастиц, они являются лучшими используется для терапевтического лечения активно кровотечения пациентам39, в то время как пациенты гематологии онкологии воспользоваться неактивированные тромбоцитов с без или низкий уровень микрочастицы20. Недавно было сообщено, что в vitro отзывчивость доноров тромбоцитов значительно не снижают восстановления и выживания этих тромбоцитов в одной переливания пациентам стабильной, главным образом-кровотечение гематологии онкологии40 . Из этого можно сделать вывод, что активации тромбоцитов, выявленные высоким содержанием MP также играет значительную роль не в профилактического лечения больных. Однако, из-за узких отбора пациентов, это исследование не рассматривается влияние факторов доноров для сложных больных фебрильных (исключены из сферы исследования), не стабильна и получить много больше, чем просто один переливания тромбоцитов. На вопрос, как можно уменьшить сложность этих пациентов дел – который обещает уменьшить огнеупорность – остается без ответа.

Микрочастицы являются ранние маркеры воспаления41,42,,4344 и тромбоцитов активации45 и поэтому обнаружен в многих обычных доноров. 19 следовательно, активированных тромбоцитов и микрочастицы, присутствуют в пожертвования тромбоцитов. Это разумно предположить, что пациентов с лихорадкой, т.е. полностью активирована врожденной иммунной системы, не может мириться с дополнительной проблемой переливание активированных тромбоцитов. Однако необходимы исследования, чтобы доказать эту гипотезу. Тонкодисперсный скрининг может облегчить текущие неопределенность в отношении содержания Трансфузии тромбоцитов и уменьшить сложность лечения пациентов.

Отношение активированного неактивированные тромбоцитов в банке крови больницы зависит, главным образом на население стран-доноров и в гораздо меньшей степени по транспорту, облучение, инактивации патогенов и других процессов, которые могут увеличить активации тромбоцитов в концентраты. 19 данных из крупных больницы крови банков в Соединенных Штатах показали, что средний состав тромбоцитов Инвентаризация 49% активирована и 51% неактивированные (диапазон для активированных тромбоцитов: 38-62%, личные сообщения). Если кровь продукта поставщиков или банков крови больницы хотят знать, сколько концентраты тромбоцитов активирована и неактивированные они производят или получить и хотят управлять их инвентаризации на основе активации тромбоцитов, как указано в тонкодисперсный содержание, это Протокол может быть подходящим для них.

Основываясь на составе тромбоцитов, банк крови больницы смогут направить неактивированные, однородной тромбоцитов для профилактического использования и активирован, гетерогенных тромбоциты для терапевтического использования. Тромбоцитов скрининг позволяет больниц для обеспечения максимального использования имеющихся запасов, которая улучшает обслуживание пациентов и снижает стоимость. Этот протокол предназначен для персонала лабораторий, которые знакомы с основной обработки и манипуляции продуктов крови.

Представленные здесь является метод скрининга для микрочастиц в трансфузии тромбоцитов, которые обычно могут применяться для управления инвентаризации банка крови больницы, где желательно выбрать продукт, основанный на содержание микрочастица. Цель настоящего Протокола заключается в наметить осуществление и оценку DLS скрининг донорской тромбоцитов. Описывается протокол рассматриваются общие вопросы неинвазивные доступ к образцы, интеграция тестирования в банк крови рабочего потока и характеристики производительности.

Protocol

Следующий протокол была выполнена нормам Канадской службы крови (CBS). Добровольцев дал согласие, что их пожертвования могут быть использованы для проведения этих исследований. Концентраты тромбоцитов были подготовлены согласно CBS стандартные оперативные процедуры. Все тестирования производительности, описанных здесь была проведена в центре для исследования крови в университете Британской Колумбии, Ванкувер, Канада с институциональной утверждения Советом этики научных исследований. 1. Проверка качества управления Выполните проверку контроля качества по крайней мере один раз за тестирование день для проверки надлежащей работы системы DLS. Измерьте предоставленные бусины (50 Нм радиус) следуя инструкциям производителя для использования. Получить управления флакон из холодного хранения и разрешить 15 минут, чтобы нагреть до комнатной температуры. Бисер должен сбалансировать к комнатной температуре перед использованием. Включите систему DLS до подготовки образца так 15 мин лазер теплый период завершена к тому времени, когда первый образец готов для тестирования. После запуска консоль, следуйте инструкциям на сенсорном экране войти в систему и выберите параметр тест системы для измерения образец элемента управления. Вихревой смешать флакон 10 s для обеспечения репрезентативной выборки. Заполните капилляр с бисером управления, с помощью 100 мкл фиксированным объемом пипетки, наконечник пипетки и капиллярной от тестовый набор. По завершении теста следуйте инструкциям на экране системы DLS.Примечание: Результаты теста шарик управления автоматически по сравнению с информацией, хранящейся в штрих-код бусина контроля и проход или сбой уведомления, а также образец информации показываются на экране системы DLS в конце теста. 2. получение образца из концентрата тромбоцитов Примечание: Эти шаги описывают процесс для неинвазивной выборки от переливания тромбоцитов в DLS тестирования капилляр для управления запасами обычных тромбоцитов. Обзор это показано на рисунке 1. Необходимые аксессуары: Труба герметик, ручной трубки зачистки, ножницы и всплеск щит. Удалите из непроверенных данных инвентаризации концентрат тромбоцитов. Получить образец продукта тромбоцитов, либо от неиспользуемых выборки мешочек (переходите к шагу 2.3) или сегмент трубы (переходите к шагу 2.4 Если пустой или шаг 2,5 Если не пустой).Чтобы отключить мешочек трубы или трубы сегмент использовать трубы герметик. Чтобы работать трубы герметик, следуйте инструкциям производителя. Вкратце Зажим трубы быть опечатаны в точное положение между двумя подогревом челюсти. В портативное устройство, нажмите, расплавленный трубы вместе и прохладно под высоким давлением, нажимая на рычаг (продолжительность обозначается зеленый свет) обусловило постоянное, герметичность уплотнения. Отбор проб из мешочек Смешать содержание тромбоцитов мешок хорошо, нежный горизонтальное движение за 5 s (чаевые от начала до конца пять раз). Откройте зажим к мешку. Мешочек эвакуированы и заполнит сам по себе. Это не необходимо полностью заполнить мешок, как только 100 мкл пример будет необходимо для тестирования DLS. Отсоедините чехол от мешок, заварены соединения труб с трубы герметик. Перейдите к шагу 3. Отбор проб из пустых труб Убедитесь, что мешок тромбоцитов труб было сохранено пустое и блок трубы до сих пор на месте. Осмотрите шланги для проверки, что не существует значительное количество концентрата тромбоцитов в трубке. Если трубка не пуста по-прежнему с шагом 2.5. Закройте трубки стриптизерша на трубке как рядом труб блок максимально сжимая ручки выжать трубы между роликами. Повесить сумку вертикально и держать сжатие ручки зачистки. В то время как сохраняя зачистки закрыт, выпуск труб блок. Медленно потяните зачистки вниз пустых труб, позволяя для трубок медленно заполнить за стриптизершей. Продолжайте до ниже зачистки раздел полностью надут или зачистки находится в пределах 1 дюйм конца трубы. Каждый раз при достижении точки остановки с стриптизерши использовать трубы герметик тепла печать трубки 1 дюйм выше зачистки. Отпустите ручки стриптизерша ручной трубки. Тепло печать снова 1 до 2 дюймов выше предыдущих печать для создания этапа тестирования. Отрезать этапа тестирования от блока тромбоцитов. Этот сегмент будет использоваться для тестирования DLS. Отбор проб из труб, который не является пустым Повесить сумку вертикально и освободить блок трубы. Осмотрите шланги для определения, если есть любые значительные твердые сгустки. Если существуют твердые сгустки, печать над ними таким образом, что они не могут быть лишены в сумку. Закройте трубку стриптизерша на трубке как недалеко от запечатанного концу шланга как можно. Стрип содержимое трубки в мешок, сжимая ручки выжать трубы между роликами и, сохраняя при этом зажима, стриптизерша трубки вдоль трубы продвигаться мешок. Удаление тромбоцитов мешок из подвесной крюк и осторожно смешать сумка для 5 s, наклоняя его от начала до конца пять раз сохраняя зачистки закрыт. Повесьте сумку вертикально при сохранении стриптизерша закрыт. Медленно потяните зачистки вниз пустых труб, позволяя для трубок медленно заполнить за стриптизершей. Продолжайте до ниже зачистки раздел полностью надут или зачистки находится в пределах 1 дюйм конца трубы. Каждый раз при достижении точки остановки с стриптизерши использовать трубы герметик тепла печать трубки 1 дюйм выше зачистки. Релиз зачистки. Тепло печать снова 1 до 2 дюймов выше предыдущих печать для создания этапа тестирования. Cut off и отменить последнюю часть трубы. Отрезать этапа тестирования от блока тромбоцитов. Этот сегмент будет использоваться для тестирования DLS. 3. Заполнение образца в DLS тестирования капилляров С помощью чистой, сухой ножницы и всплеск Щит вырезать один конец мешочек трубы или тестирование сегмента.Примечание: Капиллярные, используемые для тестирования DLS должны заполняться немедленно. Заполнение капилляра, используя средство выборки (собрал 100 мкл фиксированным объемом пипетки, наконечник пипетки и капилляров), рисовать образца непосредственно из открытой сумке или сегмента трубы в капилляр. Печать в нижней части заполненные капилляров, аккуратно вставив заполненные капилляров в капилляр герметик при применении нежный твист и некоторое давление против лоток. Отсоедините 100 мкл фиксированный объем пипеткой и кончик из капилляров, гарантируя капилляра остается прочно в капилляр герметик. Выньте капилляра из лотка герметик капиллярной трубки, протрите площадку изопропиловый спирт и убедитесь, что нет пузырьков воздуха оказались в ловушке, нежно стряхивая нижней части капилляра. Поместите капилляра в системе DLS. 4. выполнение теста DLS Выберите параметр теста MP инициировать новый DLS тест для измерения содержания микрочастица тромбоцитов образца. Введите образец информации (пожертвование идентификационный номер (ISBT), Дата окончания коллекции/производства и код продукта) с использованием сканера штрих-кодов или вручную. Если код продукта не доступен из которого система DLS можно извлечь данные жидкости среднего, выберите соответствующий текучей среды вручную (для большинства тромбоцитов концентраты выберите плазмы, но образцы, содержащие решения добавка тромбоцитов (ССА), введите процент остаточной плазмы).Примечание: Небольшое отклонение в процентах пас от номинального 65% вызовет небольшая ошибка в вязкости (автоматически вычисляется системой DLS), которая минимально влияет на вычисляемые MP радиуса, но не % MP. Поместите капилляра в системе DLS проинструктировано и запуска теста. После завершения теста, удалите образец из капилляра держателя и распоряжаться расходных материалов надлежащим образом в соответствии с руководящими принципами Фонда. Удалите образец из капилляра держателя и распоряжаться расходных материалов надлежащим образом в соответствии с руководящими принципами Фонда. Тег тромбоцитов мешок с цветом, соответствующий результат, например оранжевый неактивированные (однородные) с % МП равна или ниже 15% и розовый для активации (разнородным) с % МП выше 15%. Рисунок 1 : Метод обзор. Обзор шагов выполнялась для управления запасами обычных тромбоцитов в банке крови больницы: получение образца от тромбоцитов концентрат, загрузки образца в капилляр для измерения DLS, выполняя DLS тест, чтобы идентифицировать микрочастицы и с помощью сообщил микрочастица содержимого для идентификации активированных тромбоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Representative Results

Среднее времяТромбоцитов с использованием системы DLS процесс отбора приводится на рисунке 1. Тромбоциты являются протестирован с системой DLS в момент получения от поставщика крови. Как подробно указано в таблице 1 , время средняя приготовления для подготовленных пользователей 2 мин 23 s при очистке и времена после тестирования работы 14 s и 46 s, соответственно. В целом, средний пользователь принимает 3 мин и 23 s практический время на тест. Деятельность Активное время Ходьбы за время тестирования ИТОГО Подготовка системы DLS 14 s Соберите выборки инструмент 28 s Получить сегмент 52 s Заполнение капилляров и начать тест 49 s 5 мин Очистка 14 s Тег и инвентаризации мешок тромбоцитов 46 s Общее время, необходимое на сэмпл 3 мин 23 с 5 мин 8 мин 23 с Таблица 1: активные тестирования время разбивка. Сам тест является ходьбы от тест со средней продолжительностью 5 мин. Средний пользователь принимает 3 мин 23 с подготовить системы DLS для теста, получить и проверить образец после этого протокола и тег тромбоцитов мешок. ТочностьТочность системы DLS проводилась на трех уровнях микрочастица, 0-7%, 12-25% и 28-75%. Клинически значимых спектр % MP-3-75%. Два оператора испытания низкой, средней и высокой контрольные образцы для 16 рабочих дней на двух системах DLS параллельно. На каждый день тестирования образцов были протестированы в двух экземплярах, но в случайном порядке. В таблице 2 резюмируются внутри устройства точность измерений DLS для процентов микрочастиц (% МП) относительно тромбоцитов. Тонкодисперсный содержание Низкая Средний Высокая Означать % МП (%) 4.4 19.5 53,8 Стандартное отклонение (%) 1.8 2.6 5.8 CV (%) 40,4 13.2 10.6 Таблица 2: точность в устройство % микрочастиц (% MP). На очень низкой микрочастица содержание небольших тромбоцитов может способствовать % MP, что приводит к увеличение изменчивости для низких микрочастица контента образцов. Таблица 3 показывает внутри устройства точность измерений DLS микрочастица средний радиус между 50-550 Нм. Тонкодисперсный содержание Низкая Средний Высокая Полуось (Нм) 13s 161 188 Стандартное отклонение (мм) 133 41 25 CV (%) 40.1 25.2 13.5 Таблица 3: точность в пределах устройства микрочастица радиуса. На очень низкой микрочастица содержание небольших тромбоцитов может способствовать % микрочастиц (% МП) результате увеличение изменчивости для низких микрочастица контента образцов. Таблица 4 показывает воспроизводимость результатов измерений DLS для процентов микрочастиц (% МП). Тонкодисперсный содержание Низкая Средний Высокая Означать % МП (%) 4.4 29.2 53.6 Воспроизводимость (%) 1.5 2.3 5 CV (%) 35 11,8 9.4 Таблица 4: Воспроизводимость измерений динамического рассеяния света (DLS) для процентов микрочастиц (% МП). ЛинейностьРисунок 2 показывает, что результаты DLS линейной, т.е., подходят прямой линии связи присвоенных значений образцов. Семь образцов были подготовлены с различным содержанием микрочастица. Образцы с высоким (MP7) и низкое содержание микрочастица (MP-1) и сопоставления тромбоцитов концентрации были подготовлены и смикширован в различных соотношениях для создания промежуточных образцы (xMP). Образцы были протестированы с проточной цитометрии, как описано ранее,19 и DLS и результаты % МП на каждого концентрации были построены как ввода и вывода. Коэффициент детерминации оказалась 0.985. На рисунке 3Aприведены примеры DLS гистограммы для низкой и высокой микрочастица содержание. DLS результаты были подтверждены проточной цитометрии (рис. 3B). Рисунок 2 : Сравнение проточной цитометрии и результаты DLS. Линейная зависимость между % МП определяется поток цитометрии (вход) и DLS (выход), исходные данные DLS из двух образцов, отмеченные открытым символ ○ показаны на рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 : Содержание микрочастица различать активирована и неактивированные тромбоцитов. (A) DLS результаты содержания MP в активированных тромбоцитов (пунктирная линия) было 57% по сравнению с 4% в неактивированные тромбоцитов (сплошная линия). Испытания были проведены измерения при температуре 37 ° C, установление вязкость плазмы 1,06 x10-3 ПА·с и общая интенсивность параметров между 200-600 кГц. (B) потока цитометрии результаты (как описано ранее19) же образцов, как показано на (A); в гистограммах вперед разброс P1 и P2 представляют MP и тромбоцитов ворот, соответственно; для активированных тромбоцитов (слева) 76% событий попал в ворота MP, по сравнению с 6%-активации тромбоцитов (справа). Линии линейной регрессии предполагает постоянное относительный вклад фоновый шум % МП подачей cytometry, ведущих к неизменно высоких результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Специфика/вмешательстваМеждународной организации по стандартизации (ИСО) определяет аналитические специфику как способность процедуры измерения для обнаружения или измерения только примечании, хотя есть другие количества присутствующих в образце. Аналитическая специфика микрочастица скрининга могут быть затронуты эритроцитов (РБК). DLS измеряет содержание MP относительно содержания тромбоцитов. РБК может помешать потому, что вклад рассеяния РБК входит в вклад рассеяния тромбоцитов, уменьшение относительного вклада МП. Существуют нормативные пределы допустимого содержания РБК в продуктов крови; консервативной преобразование порога рекомендованный AABB допустимая концентрация РБК в тромбоцитов концентраты-2 мл Упакованные РБК в одной единице тромбоцитов привело 8.0 x1010 клеток/Л (предположения: РБК объем составляет 8,5 x10-14Л, Гематокрит Упакованные РБК-68%, объем тромбоцитов единицы 200 мл). Значительно ниже этого порога46сообщили остаточной концентрации РБК в различных продуктах. Три различных доноров пожертвовано тромбоцитов и эритроцитов (РБК) на двух разных дней, как право, на три независимых экспериментов. Начальное содержимое РБК в концентраты тромбоцитов (эталонный образец) был 0,05 – 0,15 x109 клеток/Л как определено с Горяева. Пять дополнительных образцов были созданы пики в известные количества РБК в аликвоты концентрата тромбоцитов; уровни целевых РБК в этих пробах были 1.0, 5.0, 10, 40 и 80 x109 клеток/л. Порог вмешательства красных кровяных клеток в приблизительно 1.0 x1010 клеток/Л (рис. 4), который также коррелирует с уровнем, при котором наличие красных кровяных клеток был визуально видно (рис. 5). Выше этого уровня % MP был недооценен, что означает, что в визуально красный образцы, которые содержат РБК, а не содержание гемоглобина сообщил микрочастица будет слишком низкой. Рисунок 4 : Линейная зависимость между % МП (РСО) и концентрация РБК (клеток/Л). Повышение концентрации РБК 0.1 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010и 8.0 x1010 клеток/Л (слева направо) от 3 независимых экспериментов (эксперимент 1 ○ ● эксперимент 2, □ эксперимент 3 линии линейной регрессии отображаются для каждого эксперимента). Выше 1.0 x1010 РБК/Л приводит к недооценке % MP. Внешний вид содержащих проб эритроцитов показано на рисунке 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5 : Внешний вид РБК, содержащие образцы. Покраснение тромбоцитов образцы содержащие РБК концентрации 0,1 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010и 8.0 x1010 клеток/Л слева направо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. ТочностьПогрешность определяется как разница между результатом одного измерения и истинное количество значение, присвоенное образца. Эта ошибка измерения включает в себя систематические оценивается путем измерения смещения и случайных компонентов оценивается стандартное отклонение. Таким образом точность результата измерения представляет собой сочетание правильность и точность. Шарик стандарт был использован для определения точности DLS теста. Точность была оценена в двух концентрациях в клинически значимых диапазон assay MP 3-75%. Ссылка бисера смеси были использованы для подготовки образцов известной концентрации, потому что ссылка бисера известного размера и концентрации. Следовательно для получения образцов с размерами частиц желаемого и концентрации могут быть смешанными ссылка бисера. Стандартный шарики полистироля с радиусом 125 Нм были использованы для представления микрочастиц и бусы с 1,5 мкм радиусом были использованы для представления тромбоцитов. Точность микрочастица assay оценивалась с шарик смеси приблизительно 20% и 50% содержание MP. Точность измерения частиц радиуса был по сравнению с радиусами частиц, документально сертификатов анализа для бисера ссылка, как показано в таблице 5. 125 Нм бусины 1,5 мкм бусины Сертификат анализа Сертификат анализа 20% МП 50% МП 20% МП 50% МП Полуось 122.0 113.8 124.4 1.5 1.6 1.60 Стандартное отклонение 4.5 2,83 3.6 0,035 0,06 0,07 РЕЗЮМЕ 3.60% 2.48% 2.89% 2,20% 3,74% 4.05% Точность 6,70% 2.00% 6,50% 6.30% Таблица 5: точность измерения динамического рассеяния света (DLS). Сравнение размеров для DLS результаты против сертификат анализа для бусины с 125 Нм 1,5 мкм радиусы и в смесях.

Discussion

Этот протокол описывает метод динамического рассеяния света для скрининга микрочастица, оптимизированный для частиц высокой концентрации, обнаруженные в биологических образцов, такие, как концентраты тромбоцитов. Изначально метод DLS нормируется точно измерить размер. Относительная Концентрация микрочастиц может быть преобразован в абсолютной концентрации если известно содержание тромбоцитов и площади пика тромбоцитов используется как ссылка пик19. Как тромбоцитов концентрации обычно получаются с гематологические анализаторы или потока цитофлуориметрами эти методы могут считаться компаньон технологий DLS.

Функциональность системы DLS застрахован, запустив управления бусины регулярно. Дистиллированная вода может быть измерена для проверки, что фоновый шум является минимальным. Коммерчески доступные тромбоцитов стандарты могут быть проанализированы как MP-отрицательные элементы управления и после добавления 125 Нм радиус бисера, как MP-позитивных элементов управления. В пределах концентрации биологических диапазон MP интерес процедуры являются практические и быстро выполнять как часть рутинной банка крови.

В отличие от проточной цитометрии этот метод не основан на сравнении интенсивности рассеяния частиц, но скорее скорость их броуновского движения. Таким образом exosomes может быть также обнаружен несмотря на свои небольшие размеры и сообщаются отдельно от MP.

Разработан как инструмент скрининга, ограничения данного метода связаны с ее неспособность различать различные виды микрочастиц. Есть потенциальные возможности для совершенствования, если используются шаги дополнительной изоляции; образцы могут быть опробованы до и после определенных удаление микрочастиц через антитела сочетании магнитных шарик захвата. Кроме того нельзя предположить, что все обнаруженные микрочастицы являются производным потому что хиломикроны, образованная в гиперлипидемии47,48 и малых бактерий или вирусов6 будет также сообщено в диапазоне микрочастица клеток. Однако другие гарантии существуют в рамках кровоснабжение, чтобы избежать высокой lipemic или загрязненных тромбоцитов войти инвентаризации банка крови больницы.

Выбор антикоагулянта в образце влияет на степень активации тромбоцитов и, следовательно, содержание MP49. Для сравнения различных продуктов этот фактор необходимо рассматривать. Кроме того, Обмен плазмы с MP свободного подвеса СМИ как ССА будет влиять на содержание MP и порог для определения неоднородности-если только около одной трети от первоначального содержания MP остается в пределах остатков плазмы в концентрате соответственно Нижний порог MP контента будет указано, такой же уровень активации тромбоцитов как 100% плазмы. Процент MP-MP содержание относительно тромбоцитов. Ранее сообщалось, что средняя тромбоцитов PAS продукта был ниже, так что средний % МП по-прежнему 9,5%19. Порог % МП для PAS тромбоцитов, лицензирована в США в настоящее время равен 10%.

Хотя основным источником MP в концентраты тромбоцитов является донором, процессы, которые вызывают стресс для тромбоцитов увеличит уровень MP в зависимости от восприимчивости тромбоцитов подчеркнуть-если уже высоко тромбоциты активируются, незначительные стрессоры такие как продлен срок годности, возбудитель инактивации, Стиральная, облучения или переноса на большие расстояния может привести к значительному увеличению содержания MP. Ни один из этих факторов стресса показали значительно повлиять на однородной, без активации тромбоцитов19. Кроме того внимание следует уделить возможности для изменения состава образца в капилляр, если не испытаны сразу же после подготовки (завершение шага 3 настоящего Протокола).

В центре внимания этого протокола находится на определении состава частиц, присутствующих в трансфузии тромбоцитов и использовать микрочастиц в качестве биомаркеров активации тромбоцитов. Трансфузии тромбоцитов помеченный как или не активирована (оранжевый) или активирована (розовый), основанный на пороге процент микрочастица 15%. Порог 15%, MP для тромбоцитов в плазме 100% эмпирически определяется какой персентили в среднем 66 с нескольких сайтов.

Тромбоцитов управления запасами на основе обычной микрочастица, скрининг с DLS призвана улучшить пациента ухода и диск эффективности затрат, предотвращая неиммунизированных тромбоцитов огнеупорность. Внедрение системы DLS для скрининга тромбоцитов сумки позволят пользователю наиболее прямой неактивированные тромбоцитов в популяциях пациентов риску развития тромбоцитов огнеупорность.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим доноров крови и персонала Канадский центр сети служб крови развития, применяемых для сбора и производства единиц тромбоцитов, используемые в данном исследовании. Мы признаем Канадский фонд для инноваций и Майкл Смит фонд для исследований в области здравоохранения для финансирования инфраструктуры в центре UBC для исследования крови. Финансирование для публикации была представлена LightIntegra Technology Inc., производитель ThromboLUX.

Materials

ThromboLUX-M LightIntegra Technology Inc.  LPN120 DLS System
ThromboSight Software LightIntegra Technology Inc.  LPN124 DLS analysis software
Capillaries LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE) LPN065 Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated
MiniPet  LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific) LPN082 100 µL fixed volume pipette for sampling  
MicroFlex 1-200 µL Pipette tips LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific) LPN080 Pipette tips for sampling
Critoseal  LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific) LPN075 Capillary Tube Sealant
Dukal Alcohol Pad or equivalent LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.) LPN085 Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol)
Control beads, 50 nm radius LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.) LPN128 Control beads
Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm PolySciences Inc. 64060 Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm PolySciences Inc. 64014-15 Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 – 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Genesis BPS RapidSeal II or equivalent Genesis BPS 428-SE640 Tube sealer
Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent Fresenius Kabi 6R4452 Manual tube stripper
Biohazard Shield – Cell Counter or equivalent CardinalHealth S1389-75 Splash Shield
Corning LSE Vortex Mixer or equivalent Corning Incorporated 6775 Vortex mixer
FACSCanto II Flow cytometer  with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent BD Biosciences 338960 Flow cytometer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Dinkla, S., et al. Platelet microparticles inhibit IL-17 production by regulatory T cells through P-selectin. Blood. 127 (16), 1976-1986 (2016).
  2. Yin, W., Ghebrehiwet, B., Peerschke, E. I. Expression of complement components and inhibitors on platelet microparticles. Platelets. 19 (3), 225-233 (2008).
  3. Aatonen, M., Gronholm, M., Siljander, P. R. Platelet-derived microvesicles: multitalented participants in intercellular communication. Semin Thromb Hemost. 38 (1), 102-113 (2012).
  4. Suades, R., Padro, T., Alonso, R., Mata, P., Badimon, L. High levels of TSP1+/CD142+ platelet-derived microparticles characterise young patients with high cardiovascular risk and subclinical atherosclerosis. Thromb Haemost. 114 (6), 1310-1321 (2015).
  5. Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for “on-chip” qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosens Bioelectron. 93, 250-259 (2017).
  6. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  7. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Semin Thromb Hemost. 36 (8), 807-818 (2010).
  8. Lacroix, R., et al. Standardization of platelet-derived microparticle enumeration by flow cytometry with calibrated beads: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. J Thromb Haemost. 8 (11), 2571-2574 (2010).
  9. Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Lopez, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
  10. Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
  11. Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thromb Haemost. 103 (5), 1044-1052 (2010).
  12. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. van der Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. J Thromb Haemost. 11, 36-45 (2013).
  15. Boudreau, L. H., et al. Platelets release mitochondria serving as substrate for bactericidal group IIA-secreted phospholipase A2 to promote inflammation. Blood. 124 (14), 2173-2183 (2014).
  16. Rousseau, M., et al. Detection and quantification of microparticles from different cellular lineages using flow cytometry. Evaluation of the impact of secreted phospholipase A2 on microparticle assessment. PLoS One. 10 (1), 0116812 (2015).
  17. Groot Kormelink, T., et al. Prerequisites for the analysis and sorting of extracellular vesicle subpopulations by high-resolution flow cytometry. Cytometry A. 89 (2), 135-147 (2016).
  18. van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  19. Maurer-Spurej, E., Larsen, R., Labrie, A., Heaton, A., Chipperfield, K. Microparticle content of platelet concentrates is predicted by donor microparticles and is altered by production methods and stress. Transfus Apher Sci. 55 (1), 35-43 (2016).
  20. Maurer-Spurej, E., et al. Platelet quality measured with dynamic light scattering correlates with transfusion outcome in hematologic malignancies. Transfusion. 49 (11), 2276-2284 (2009).
  21. Hess, J. R., et al. Clinical and laboratory correlates of platelet alloimmunization and refractoriness in the PLADO trial. Vox Sang. 111 (3), 281-291 (2016).
  22. Doughty, H. A., et al. Relative importance of immune and non-immune causes of platelet refractoriness. Vox Sang. 66 (3), 200-205 (1994).
  23. Vassallo, R. R., Norris, P. J. Can we “terminate” alloimmune platelet transfusion refractoriness. Transfusion. 56 (1), 19-22 (2016).
  24. Anderson, W., Kozak, D., Coleman, V. A., Jaemting, A. K., Trau, M. A comparative study of submicron particle sizing platforms: Accuracy, precision and resolution analysis of polydisperse particle size distributions. J colloid inter sci. 405, 322-330 (2013).
  25. Gyoergy, B., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. Plos One. 7 (11), 49726-49726 (2012).
  26. Urey, C., et al. Combining gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis (GEMMA), light scattering, field flow fractionation and cryo electron microscopy in a multidimensional approach to characterize liposomal carrier vesicles. Int J Pharm. 513 (1-2), 309-318 (2016).
  27. Mohr, K., et al. Evaluation of multifunctional liposomes in human blood serum by light scattering. Langmuir. 30 (49), 14954-14962 (2014).
  28. Maurer-Spurej, E., Brown, K., Labrie, A., Marziali, A., Glatter, O. Portable dynamic light scattering instrument and method for the measurement of blood platelet suspensions. Physics in Medicine and Biology. 51 (15), 3747-3758 (2006).
  29. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  30. Ambrose, A. R., Alsahli, M. A., Kurmani, S. A., Goodall, A. H. Comparison of the release of microRNAs and extracellular vesicles from platelets in response to different agonists. Platelets. , 1-9 (2017).
  31. Buzas, E. I., Gardiner, C., Lee, C., Smith, Z. J. Single particle analysis: Methods for detection of platelet extracellular vesicles in suspension (excluding flow cytometry). Platelets. 28 (3), 249-255 (2017).
  32. Stoner, S. A., et al. High sensitivity flow cytometry of membrane vesicles. Cytometry A. 89 (2), 196-206 (2016).
  33. Labrie, A., Marshall, A., Bedi, H., Maurer-Spurej, E. Characterization of platelet concentrates using dynamic light scattering. Transfus Med Hemother. 40 (2), 93-100 (2013).
  34. Ueba, T., et al. Plasma level of platelet-derived microparticles is associated with coronary heart disease risk score in healthy men. J Atheroscler Thromb. 17 (4), 342-349 (2010).
  35. Badimon, L., Suades, R., Fuentes, E., Palomo, I., Padro, T. Role of Platelet-Derived Microvesicles As Crosstalk Mediators in Atherothrombosis and Future Pharmacology Targets: A Link between Inflammation, Atherosclerosis, and Thrombosis. Front Pharmacol. 7, 293 (2016).
  36. Berezin, A. E., Kremzer, A. A., Berezina, T. A., Martovitskaya, Y. V. The pattern of circulating microparticles in patients with diabetes mellitus with asymptomatic atherosclerosis. Acta Clin Belg. 71 (1), 38-45 (2016).
  37. Marcoux, G., et al. Microparticle and mitochondrial release during extended storage of different types of platelet concentrates. Platelets. 28 (3), 272-280 (2017).
  38. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
  39. Reddoch, K. M., et al. Hemostatic function of apheresis platelets stored at 4 degrees C and 22 degrees C. Shock. 41, 54-61 (2014).
  40. Kelly, A. M., et al. The effect of variation in donor platelet function on transfusion outcome: a semirandomized controlled trial. Blood. 130 (2), 214-220 (2017).
  41. Peerschke, E. I., Yin, W., Ghebrehiwet, B. Platelet mediated complement activation. Adv Exp Med Biol. 632, 81-91 (2008).
  42. Redman, C. W., Sargent, I. L. Microparticles and immunomodulation in pregnancy and pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 61-67 (2007).
  43. Ripoche, J. Blood platelets and inflammation: their relationship with liver and digestive diseases. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 35 (5), 353-357 (2011).
  44. Ling, Z. L., Combes, V., Grau, G. E., King, N. J. Microparticles as immune regulators in infectious disease – an opinion. Front Immunol. 2, 67 (2011).
  45. Melki, I., Tessandier, N., Zufferey, A., Boilard, E. Platelet microvesicles in health and disease. Platelets. 28 (3), 214-221 (2017).
  46. Culibrk, B., et al. Application of the ADVIA cerebrospinal fluid assay to count residual red blood cells in blood components. Vox Sang. 103 (3), 186-193 (2012).
  47. Connolly, K. D., et al. Lipoprotein-apheresis reduces circulating microparticles in individuals with familial hypercholesterolemia. J Lipid Res. 55 (10), 2064-2072 (2014).
  48. Mork, M., et al. Prospects and limitations of antibody-mediated clearing of lipoproteins from blood plasma prior to nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1308779 (2017).
  49. Raczat, T., et al. The influence of four different anticoagulants on dynamic light scattering of platelets. Vox Sang. 107 (2), 196-199 (2014).

Tags

Platelet TransfusionsMicroparticle ContentPlatelet ActivationRoutine Screening MethodDynamic Light ScatteringPlatelet Concentrate SamplingTube StripperTubing Segment Sampling

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Millar, D., Murphy, L., Labrie, A., Maurer-Spurej, E. Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions. J. Vis. Exp. (131), e56893, doi:10.3791/56893 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image