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Ambiente

Vor-Ort-molekulare Erkennung von bodenbürtige Phytopathogene mit einem tragbaren Echtzeit-PCR-System

Published: February 23, 2018
doi:
10.3791/56891
, , , , , ,
1Department of Plant Pathology,Washington State University, 2Parma Research and Extension Center,University of Idaho

Summary

Schnelle und präzise Erkennung von Krankheitserregern vor Ort, vor allem bodenbürtige Pflanzenpathogene, ist wichtig zur Vermeidung weiterer Inokulum Produktion und Verbreitung von Pflanzenkrankheiten im Feld. Die entwickelte Methode hier über eine tragbare Echtzeit-PCR-Detection-System ermöglicht vor Ort Diagnose unter Feldbedingungen.

Abstract

Vor-Ort-Diagnose von Pflanzenkrankheiten kann ein nützliches Werkzeug für Züchter für rechtzeitige Entscheidungen ermöglichen die frühere Umsetzung von Disease Management-Strategien, die Verringerung der Auswirkungen der Krankheit sein. Derzeit in vielen diagnostischen Laboren, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), insbesondere Echtzeit-PCR gilt als sensibel und präzise Methode zur Pflanze Erregernachweis. Labor-basierte PCRs erfordern jedoch in der Regel teure Laborausstattung und geschultes Personal. In dieser Studie werden bodenbürtige Krankheitserreger der Kartoffel verwendet, um das Potenzial für vor-Ort-molekulare Erkennung zu demonstrieren. Dies gelang mit Hilfe eines schnellen und einfachen Protokolls bestehend aus magnetischer Wulst-basierte Nukleinsäure-Extraktion, tragbare Echtzeit-PCR (Fluorogenic Testbasierte Assay). Der tragbare Echtzeit-PCR-Ansatz im Vergleich günstig mit einem Labor-basiertes System, erkennen so wenig wie 100 Kopien der DNA aus Spongospora Subterranea. Die tragbaren Echtzeit-PCR-Methode entwickelt, hier kann als Alternative zum Labor-basierte Ansätze und ein vor-Ort-nützliches für Erreger Diagnose dienen.

Introduction

Genaue und schnelle Identifizierung der verursachenden Erreger wirkt deutlich Entscheidungen in Bezug auf Pflanze-Disease-Management. Bodenbürtige Krankheiten sind besonders schwer zu diagnostizieren, da die Bodenumwelt sehr groß im Verhältnis zu Werk Masse und komplex ist, so dass es eine Herausforderung, alle Aspekte der bodenbürtige Krankheiten zu verstehen. Darüber hinaus können bodenbürtige Krankheiten Schulteroperationen während der frühen Stadien der Infektion, abhängig von Umweltstressfaktoren, und einige haben lange Latenzzeiten, die verzögerte Diagnosen1führen. Viele bodenbürtige Krankheitserreger entwickelten überleben Strukturen, wie z. B. spezialisierte Sporen oder Melanized Hyphen, die seit vielen Jahren auch in Abwesenheit ihrer Wirte im Boden überleben können. Verwendeten Ansätze für bodenbürtige Krankheiten umfassen: Vermeidung von bekannten befallenen Felder, Verwendung von Pathogen-freies zertifiziertes Saat- und Pflanzgut halten Geräte Sanitär und Einschränkung der Bewegung von Erde und Wasser, wenn möglich. Wissen über das Vorhandensein der Erreger durch molekulare Erkennung Strategien kann auch eine nützliche Rolle spielen, durch rechtzeitige Entscheidungen bezüglich Frühphasen-Behandlungen oder Pre-Pflanzen Bewertungen der Felder. Vor-Ort-Prüfung bietet zusätzliche Vorteile bieten ein schnelles Ergebnis ohne der Probe zu einem diagnostischen Labor zu senden, dass vielleicht etwas Abstand entfernt und auch den Züchter eingreifen kann wenn eine solche Diagnose ist “Feld-Side” in ihrer Gegenwart durchgeführt.

Für die vor-Ort-Diagnose anhand der molekularen Erkennung, Sensitivität, Spezifität, Robustheit (Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit) und Effizienz (IE., Einfachheit und Preis-Leistung) sind entscheidende Faktoren für die Prüfung. Lateral Flow Geräte (LFDs) wie die Immunostrip und PocketDiagnostic sind populäre Methoden für vor-Ort-Erregernachweis wegen ihrer Einfachheit als eine One-Step-Assay. Jedoch LFDs rechts Diagnosewerkzeug in allen Situationen möglicherweise nicht weil sie ermangeln die Sensitivität und Spezifität und gelegentlich mehrdeutige Ergebnisse liefert, wenn der Ziel-Erreger in geringen Konzentrationen ist und kann mit ähnlichen Arten oder Gattungen Kreuzreaktion 2. Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) gilt auch für vor-Ort-Erregernachweis und ist besonders preiswert durch günstige Reagenzien, Reaktionsbedingungen, die konstant bleiben und einfach farbmetrischen visuelle Analyse. Allerdings LFDs und Lampe dienen in der Regel qualitativ, obwohl beide Ansätze quantitativ mit teurer Ausrüstung3verwendet werden können. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bietet hohe Spezifität, hohe Empfindlichkeit und eine quantitative Fähigkeit im Vergleich zu den oben genannten Methoden der Erkennung. Die konventionelle Lab-PCR Technologie erfordert jedoch teure Laborausstattung und geschultes Personal, das ist ein großer Nachteil bei der Annahme dieser Technologie als ein Nachweisverfahren für vor-Ort-Zwecke.

In diesem Protokoll wird eine vor-Ort-diagnostische Methode, die mit einem tragbaren Echtzeit-PCR Instrument demonstriert. Echtzeit-PCR-Technologie bietet Vorteile gegenüber anderen Methoden im Hinblick auf die quantitative Genauigkeit, Sensitivität und Vielseitigkeit und weithin für die Erfassung eines breiten Spektrums der Pflanze Krankheitserreger4,5, einschließlich der verschiedenen Kartoffel-Erreger im Boden6. Aufgrund der jüngsten Trends der schnell wachsenden, wettbewerbsfähigen Markt hat notwendige Ausstattung für PCR-Technologie weiterhin kompakter und preiswerter7zu entwickeln. Das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: magnetischer Wulst-basierte Nukleinsäure-Extraktion, tragbare Echtzeit-PCR (Fluorogenic Testbasierte Assay) und quantitative Datenanalyse, die alle aus der Ferne mit einem Laptop-Computer (Abbildung 1) getan werden kann.

Mit dem tragbaren PCR-Protokoll hier entwickelt, Bodenproben wurden analysiert, um die bodenbürtige Krankheitserreger, Spongospora Subterraneaerkennen. Spongospora wurde gewählt, weil es eine wichtige Kartoffel Erreger als kausale Vertreter des pulverförmigen Schorf8ist. In den letzten Jahrzehnten gilt das Vorhandensein dieser Erkrankung zu vielen Regionen ausgebreitet haben, wo Kartoffeln9,10angebaut werden. Pulverförmige Schorf, durch das Vorhandensein von Pickel wie Läsionen an den Knollen kann Kartoffelerzeuger erhebliche qualitative Ertragsverluste verursachen. Darüber hinaus können S. Subterranea Kartoffel Mop Top Virus (PMTV), Vektor, die Knollen (bekannt als Spraing)11,12interne Läsion Symptome hervorrufen können. Daher ist es wichtig zu wissen, ob S. Subterranea in Feldern vor der Pflanzung6vorhanden ist. Wir zeigen auch die Nützlichkeit dieses Protokolls für den Nachweis von Rhizoctonia Solani Anastomose Gruppe 3 (AG3) und PMTV. Obwohl mehrere Anastomose Gruppen von Rhizoctonia Solani in Kartoffeln Krankheiten auslösen, AG3 ist wohl die wichtigste weltweit13verursacht Stamm Canker und schwarzer Schorf, was zu marktfähigen Ertragsverluste von bis zu 30 %14. PMTV verursacht nekrotische Läsionen innerhalb der Knollen, die häufig Spraing genannt werden. Dieses Virus wurde vor kurzem zum ersten Mal berichtet in mehreren Staaten im pazifischen Nordwesten15,16,17und der zunehmenden Sorge für Landwirte in dieser wichtigen Kartoffel wachsenden Region ist. Neben der Bestimmung der Wirksamkeit von tragbaren PCR für diese wichtigeren Krankheiten, optimale DNA Extraktion Methodik und Boden Stichprobenumfang wurden auch in dieser Studie untersucht.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die tragbare PCR-Methode vielseitig und für die Erkennung von verschiedenen Krankheitserregern geltenden ist. Die vor-Ort-Nachweismethode, die wir entwickelt kann die frontline-Mitarbeiter in der Landwirtschaft (z. B. Züchter), frühere Entscheidungen bezüglich Disease-Management, wie verschiedene Auswahlen oder Rotationen, treffen und quantifizieren kann eine Pflanze-Erreger in der Probe während einer Feldstudie vor der Pflanzung, um mögliche Krankheitsausbrüche zu vermeiden.

Protocol

1. vor-Ort-molekulare Nachweis von Krankheitserregern, die mit einem tragbaren Real-Time PCR System Hinweis: Siehe Abbildung 1. Magnetischer Wulst-basierte DNA-ExtraktionHinweis: Ein magnetischer Wulst-basierte DNA Extraktion Kit (z.B. von Primeretablierung) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers benutzt. Alle Reagenzien sollte bei Raumtemperatur (18-25 ° C) gelagert werden. Sobald die lyophilisierten Proteinase K (Flasche No. 1) gesperrt ist (mit Flasche 1a), Lagerung bei-20 ° C. Vermischen Sie 20-50 mg der Bodenprobe mit 500 µL Probe-Prep-Lösung in einem Reaktionscup.Hinweis: Das Verhältnis der Erde: Prep Lösung ist wichtig wie mischen sie in anderen Verhältnissen kann dazu führen, dass ein Versagen der nachgeschalteten Experimente (z. B. Verunreinigungen durch Inhibitoren der PCR). Schleifen Sie den Boden auf der Unterseite des Rohres mit einem kleinen sterilen Stößel, bis die Lösung trüb ist. Weiter auszusetzen Bodenpartikel in die Lösung durch die Reaktionscup schütteln und lassen Sie es stehen lassen den Boden Partikel völlig absetzen ungestört, (in der Regel zwischen 5 bis 10 min). 200 µL des Überstandes in eine frische Reaktionscup übertragen und fügen Sie 200 µL Lysis Puffer (Flasche Nr. 2: Guanidin-Hydrochlorid-Lösung) und 20 µL Proteinase K (Flasche No. 1). Durch Umdrehen der Röhre gründlich die lysate mischen und bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.Hinweis: Wenn die lysate auf dem Reaktionscup Deckel gefunden wird, tippen Sie auf das Rohr oder verwenden Sie eine Zentrifuge zu, falls vorhanden, aus dem Deckel zu entfernen. Die lysierten Probe 500 µL Bindung Puffer/magnetischer Wulst-Mix (Flasche Nr. 3) hinzufügen. Mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten entfernt von der magnetischen Rohr-Rack.Hinweis: Achten Sie darauf, mischen Sie die Wulst-Lösung vor Gebrauch sicherstellen, dass die Perlen aus der Vorratsflasche gleichmäßig regelmÄÑig sind gut. Legen Sie die Reaktionscup auf dem magnetischen Rohr Gestell. Warten Sie am wenigsten 2 min oder bis die Perlen in die Reaktionscup an der magnetischen Seite Wand befestigen. Dann entfernen Sie und entsorgen Sie aller Überstand durch pipettieren.Hinweis: Stören Sie die magnetisierten Perlen nicht beim Entfernen und Absaugen des Überstands. DNA wurde jetzt durch die magnetischen Beads erfasst. Die Reaktionscup aus dem magnetischen Rohr Gestell zu entfernen, fügen Sie 500 µL der Wash Buffer-1 (Flasche Nr. 4: Natrium-Perchlorat/Ethanol-Lösung) und hängen Sie wieder die Perlen durch wiederholte pipettieren, bis die Perlen gleichmäßig verteilt sind. Führen Sie diesen Waschschritt um Eiweiß und Salz aus der Probe zu entfernen. Lassen Sie die Mischung sitzen für 30 s. Wiederholen Sie Schritt 1.1.6. Die Reaktionscup aus dem magnetischen Rohr Gestell zu entfernen, fügen Sie 500 µL der Wash Buffer-2 (Flasche Nr. 5: Natrium-Perchlorat/Ethanol-Lösung) und hängen Sie wieder die Perlen durch wiederholte pipettieren, bis die Perlen gleichmäßig verteilt sind. Lassen Sie die Mischung sitzen für 30 s. Wiederholen Sie Schritt 1.1.6. Entfernen Sie die Reaktionscup aus dem magnetischen Rohr Gestell und fügen Sie 500 µL Ethanol 80 % (Flasche Nr. 6).Hinweis: Dieser Schritt ist notwendig für die Beseitigung der restlichen Salze aus der Probe. Wieder aussetzen Sie, die Perlen durch wiederholte pipettieren, bis die Perlen gleichmäßig verteilt sind. Lassen Sie dieser Ständer für 10 min mit dem gelegentlichen mischen durch umdrehen. Wiederholen Sie Schritt 1.1.6. Luft trocknen das magnetische Wulst Pellet für 10 min bei Raumtemperatur mit dem Reaktionscup Deckel geöffnet.Hinweis: Die Perlen sollten frei von jeder sichtbare Rückstände Ethanol aber nicht völlig ausgetrocknet. Entfernen Sie die Reaktionscup aus der magnetischen Rohr Rack, 50-200 µL der Elution Buffer (Flasche Nr. 7) hinzufügen und erneut unterbrechen die Perlen durch wiederholte pipettieren, bis die Perlen gleichmäßig verteilt sind und lassen Sie sie stehen für 30 s.Hinweis: In den obigen Schritten wird die gereinigte DNA aus der magnetischen Kügelchen in der Elution Buffer freigegeben. Legen Sie die Reaktionscup auf dem magnetischen Rohr Gestell. Warten Sie am wenigsten 2 min oder bis die Perlen in die Reaktionscup an der magnetischen Seite Wand befestigen. Übertragen des Überstands, der nun gereinigte DNA/RNA, eine 0,5 mL Reaktionscup für den Einsatz in der nachgelagerten Schritte enthält. Tragbare Real-Time PCRHinweis: Eine tragbare Thermocycler und das PCR-Assay-Kit wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet (siehe die Tabelle der Materialien). Öffnen Sie und führen Sie die Thermocycler-assoziierten Software aus, wählen Sie Ziel-Erkennungstest und geben Sie die Beschreibung-Daten in die Datenfelder Eintrag Name & Details, Notizen, Proben und Tests .Hinweis: Wells #1 und #2 sind durch die Software für die negativ-Kontrolle und die positive Kontrolle gekennzeichnet. Bereiten Sie PCR Reagenzien vor dem Gebrauch. Übertragen Sie 500 µL des Puffers Resuspension master-Mix in der Röhre mit lyophilisierten master-Mix und Mix gut durch Umkehrung. Übertragen Sie die gesamten master-Mix in die braunen Reaktionscup mit der Bezeichnung Primer/Sonden (Tabelle 2). Deckel und schütteln Sie die Reaktionscup Mix. Gute Durchmischung ist erforderlich, um sicherzustellen, dass alle Komponenten komplett neu ausgesetzt sind. Lassen Sie diese Mischung für 5 min vor Gebrauch zu sitzen.Hinweis: Speichern Sie die Reaktion Mischung bei-20 ° C nach dem Gebrauch. Bereiten Sie eine negative Kontrolle durch die Übertragung von 10 µL des vorbereiteten Reaktion-Mix aus dem vorherigen Schritt in ein 0,2 mL PCR-Gefäß und fügen Sie dann 10 µL steriler Nuklease-freie deionisiertes Wasser. Vorbereiten einer positiven Kontrolle durch die Übertragung von 10 µL des vorbereiteten Reaktion-Mix aus dem Schritt 1.2.2 in ein 0,2 mL PCR-Gefäß und fügen Sie dann 10 µL der Positivkontrolle Vorlage. Übertragen Sie für jede Probe 10 µL des vorbereiteten Reaktion-Mix aus dem vorherigen Schritt in ein 0,2 mL PCR-Gefäß zu, und fügen Sie 10 µL der Probe DNA aus Schritt 1.1.16 vorbereitet. Laden Sie die Vertiefungen der Thermocycler mit dem Inhalt von ihren jeweiligen PCR-Röhren, wie unter Punkt 2.1.1 beschrieben. Sobald alle notwendige Informationen eingegeben und bestätigt wurde, wählen Sie Start ausführen und wählen Sie entweder das Ethernet angeschlossen Gerät oder ein USB-Laufwerk.Hinweis: Wenn die USB-Laufwerk-Option ausgewählt ist, muss die Laufe-Datei auf dem Laufwerk mit den Thermocycler (z. B.F:\genesig) verwendet werden gespeichert werden. Der Lauf beginnt unmittelbar nach der Fahrt in den Thermocycler eingefügt wird. Datenanalyse von tragbaren Real-Time PCR. Sobald die Ausführung abgeschlossen ist, öffnen Sie die geführte Datei (.usb) vom USB-Stick mit der Thermocycler-assoziierten Software oder zeigen Sie direkt die Laufergebnisse in der Software indem Sie auf Ergebnisse an. Vor der Analyse der Ergebnisse, Speichern der abgeschlossenen ausführen, um Datenverlust zu vermeiden. In der Registerkarte ” Ergebnisse ” zeigen Sie den Status des Laufs, kategorisiert nach Proben.Hinweis: Daten, die in diesem Register abgerufen werden können sind der Status der Ergebnisse und kopieren Anzahl in der Probe festgestellt. Klicken Sie auf die Registerkarte ” Details “, um die Verstärkung Kurven anzuzeigen. Wenn das Ziel erfolgreich erkannt wird, werden Cq (Quantifizierung Zyklus) Werte des Ziels und interne Kontrolle angezeigt.Hinweis: Diese Werte werden im Abschlussbericht berechnet und werden verwendet, um festzustellen, ob eine Probe für das Ziel positiv ist und wenn es Probleme mit der Reaktion oder die DNA-Proben. (2) andere Protokolle Labor-basierte DNA Extraktion Alternativmethoden CTAB-Phenol-Chloroform-basierten Methoden Durchführen Sie CTAB-Phenol-Chloroform-basierte Methoden, nach der Doyle Methode18 und der Dellaporta Methode19 , wie oben beschrieben. DNA-Mini-ZubereitungHinweis: Die Edwards Methode20 wurde wie folgt durchgeführt. Hinzu kommen 500 mg des Bodens, gefolgt von fünf 1,4 mm Keramik Perlen und 750 µL Edwards Puffer (200 mM Tris, pH 8.0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5 % SDS) eine Reaktionscup und Mischung gut. Inkubieren Sie die Reaktionscup bei 65 ° C für 5 min. Homogenisieren die Probe mit einer Perle Schläger Homogenisator für 60 s (oder mit einem Mörser und Pistill). Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 x g für 5 min. Übertragen Sie 500 µL Überstand auf eine frische Reaktionscup und dann mischen Sie mit 500 µL gekühlte Isopropanol. Durch Umkehrung der Röhre 10 Mal mischen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 x g für 15 min, um die DNA zu granulieren. Abgießen Sie den Überstand und lassen Sie die DNA-Pellet-Luft bei Zimmertemperatur trocknen, bis die restlichen Ethanol verdampft ist. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 750 µL gekühlte 70 % Ethanol. Luft trocknen das Pellet vor Aussetzung wieder in 50-100 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 und 1 mM EDTA). Andere Alternative Methoden Silica-Base DNA-Extraktion mit Kit #1 (MP-BIO schnell drehen DNA) durchführen und kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) gemäss den Anweisungen des Herstellers. Konventionelle Lab-basierte Echtzeit-PCR.Hinweis: Eine konventionelle Thermocycler diente mit Mastermix Testbasierte PCR, verschiedene Grundierungen und Oligonukleotid Sonden (Tabelle 2). Mit undurchsichtigen Talsohle PCR Rohre oder eine PCR-Platte vorbereiten 20 µL Reaktionen für alle DNA-Proben analysiert werden, als auch eine Negative Kontrolle (Nuklease-freie deionisiertes Wasser) und eine positive Vorlagensteuerelement vorbereitet im eigenen Haus. Für jede PCR Rohr oder gut, bereiten Sie eine Mischung einschließlich 10 µL der Mastermix, 7 µL Nuklease-freie deionisiertes Wasser, 2 µL 2 µM Primer/Sonden und 1 µL DNA-Probe (ab Schritt 1.1.16 oder 2.1) oder Steuerelementvorlage pro Probe. Schließen Sie die PCR-Röhrchen oder Platte und beginnen Sie die Reaktion durch Auswahl der entsprechenden PCR-Programms. Datenanalyse von konventionellen Labor-basierte Echtzeit-PCR Verwenden Sie Thermocycler-assoziierten Software, um die Ergebnisse aus der konventionellen Thermocycler zu analysieren. Um die Datenanalyse zu beginnen, übertragen Sie laufen Datei auf ein USB-Laufwerk aus der Thermocycler, schließen Sie ein USB-Laufwerk und wählen Sie exportieren. Öffnen die Datendatei (.pcrd) aus der exportierten laufen in den Thermocycler-assoziierten Software. Markieren Sie den Brunnen einer Probe durch die Lokalisierung ihrer entsprechend gut auf das Instrument. Verstärkung-Kurven und Standardkurven (falls zutreffend) werden automatisch generiert. Wenn die Beispielinformationen nicht eingegeben haben, klicken Sie auf Platte Setup oder eine ähnliche Funktion, um die Dateneingabe zu beginnen, bevor Sie Daten analysieren. Zeigen Sie die Daten auf der Registerkarte “Quantifizierung”; Dies kann für die Datenanalyse mit einer Drittanbieter-Software wie CSV, XML oder HTML-Datei-Reader exportiert werden. Erhalten Sie Cq-Daten anhand der festgelegten Schwellenwerte zu und vergleichen Sie es mit der positiven und negativen Kontrollen.Hinweis: Wenn die DNA-Standards des Ziels in der Assay verwendet wurden, vergleichen Sie die Cq Beispieldaten, die Standards zu bestimmen, die Cq-Cut-off

Representative Results

Vergleich der DNA-Extraktionsmethoden Die Vereinbarkeit einer magnetischen Wulst-basierte DNA Extraktion Methode mit Real-Time PCR wurde bewertet, durch das Erkennen von Mengen von S. Subterranea DNA in einer Bodenprobe aus Bereichen, die mit dem Erreger befallen. Wie zusätzliche Abbildung 1zeigt, wurde die magnetische Wulst-basierte Methode mit den anderen Methoden einschließlich CTAB-Phenol-Chloroform-basierte Methode18, schnellen DNA-Mini-Vorbereitung Methoden19,20, und andere verglichen. Standard Silica-basierten DNA Extraktion Kits. DNA-Proben mit den sechs verschiedenen Methoden extrahiert wurden konventionelle Lab-basierte Echtzeit-PCR unterzogen. Die Ergebnisse vorgeschlagen, dass die magnetische Wulst-basierte Methode vergleichbar mit den anderen Methoden, obwohl Silica-basierten DNA-Extraktion Kit zeigte die beste Leistung unter den Methoden, die wir getestet. Alle Kits enthalten Guanidinium-Thiocyanat oder Guanidinium Hydrochlorid: beide sind leistungsfähige chaotropen-Agents, die meisten von zellulären Proteinen einschließlich RNases und DNasen denaturieren. Daher eignet sich mit den Methoden für die DNA- und RNA-Extraktion. Vergleich zwischen einem tragbaren Real-Time PCR und einer konventionellen Labor-basierte Echtzeit-PCR Vergleich der Sensitivität und Spezifität eines tragbaren PCR eine konventionelle Lab basierende PCR, absolute Quantifizierung des Erregers, die DNA mit Hilfe unterschiedliche Mengen des Gens S. Subterranea ITS, die durch das pGEM-T-Vektor21 getragen wurde durchgeführt wurde . Eine Reihe von 10-divisibel Verdünnungen des ITS-Gens (106 bis 100 Kopien) wurden mit dem SsTQ Primer/Sonden Set22analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die tragbare PCR-Methode den Ziel-Erreger DNA erkannt (~ 100 Exemplare), obwohl die Empfindlichkeit wurde 10 Mal niedriger als der konventionelle Lab basierende PCR Methode, die mindestens 10 Exemplare (Abbildung 2) erkannt. Für weitere Validierung wurden künstlich verseuchte Böden getestet. S. Subterranea Sporosori wurden von pulverförmigen Schorf Wurzel Gallen aus Kartoffel Wurzeln erhalten. Die Böden waren mit Sporosori Suspensionen auf eine Endkonzentration von 105 Sporosori/g Trockengewicht des Bodens befallen. Mit der magnetischen Wulst-basierte Methode, DNA wurde aus den befallenen Bodenproben entnommen, und 10-divisibel Verdünnungsreihen bereit waren, Konzentrationen bis 10 gleichwertig zu erhalten5, 104, 103, 102, 101und 100 Sporosori/g Trockengewicht des Bodens. Die DNA-Proben wurden für die PCR unter Verwendung der SPO Primer/Sonden Set23verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die tragbare PCR-Methode vergleichbare analytische Fähigkeit, eine konventionelle Lab basierende PCR Methode hat aber wieder, sich die Empfindlichkeit um den Faktor 10 (Abbildung 3 verringerte). Zu guter Letzt haben wir eine Bodenprobe aus einem Feld, das natürlich mit S. Subterraneaverunreinigt wurde getestet. Die magnetische Wulst-basierte DNA-Extraktion erfolgte auf unterschiedliche Mengen an Böden (10, 20, 50 und 100 mg des Bodens pro 500 µL Puffer Extraktionslösung). Die Ergebnisse vorgeschlagen, dass das optimale Gewicht des Bodens als Ausgangsmaterial für die DNA-Extraktion 50-100 mg (Abbildung 4). Boden-Mengen außerhalb des Bereichs verursachte einen Fehler der nachgeschalteten PCR Schritte. Dieser Effekt könnte sein, denn wenn Mehrbeträge des Bodens als Ausgangsmaterial verwendet werden, die PCR-24Verunreinigungen (z.B. Phenole) stören können. Bei geringeren Mengen des Bodens kann die Höhe der extrahierten DNA niedriger sein als die Nachweisgrenze der PCR (z.B. die Ausbeute an insgesamt, die aus 10-20 mg Boden extrahierte DNA verändert wurde). Empfindlichkeit war ziemlich vergleichbar zwischen den tragbaren PCR und konventionelle PCR-Methoden. Ähnliche Ergebnisse wurden in DNA-Proben von verschiedenen Extraktionsmethoden (ergänzende Abbildung2) erzielt. Erkennung von anderen Krankheitserregern durch das vor-Ort-Detection-System mit einem tragbaren Real-Time PCR Wir testeten die tragbaren PCR Methode um andere wichtige Kartoffel bodenbürtige Krankheitserreger, R. Solani AG3 und PMTV zu erkennen. In dieser Studie haben wir Real-Time PCR unter Verwendung der RsTq Primer/RQP1 Sonde Set25 für R. Solani AG3 Detektion mit DNA aus Reinkultur durchgeführt. Wir führten auch Echtzeit-PCR mit den PMTV-D Primer/Sonden Set26 für PMTV-Erkennung mit RNA aus einem Spraing symptomatisch Knolle Sample verwendet wurde. Wie in Abbildung 5gezeigt, entdeckt die tragbaren PCR-Methode erfolgreich beide Krankheitserreger. Die Ergebnisse waren vergleichbar zwischen den tragbaren und herkömmlichen Instrumenten, darauf hindeutet, dass die tragbare PCR-Methode ist vielseitig und auf andere Erreger Erkennungen anwendbar wenn die Primer-Sequenzen entwickelt für Real-Time PCR zur Verfügung stehen. Abbildung 1. Verfahren ein tragbares Echtzeit-PCR-System für vor-Ort-Erregernachweis. Das Protokoll setzt sich aus Schritte in der folgenden Reihenfolge: lysate Vorbereitung durch kurze Homogenisierung (A), magnetischer Wulst-basierte Nukleinsäure-Extraktion (B) portable Echtzeit-PCR (C) und quantitative Datenanalyse mit einem Laptopcomputer (D). Beachten Sie, dass alle Schritte vor Ort abgeschlossen werden können. Abbildung 2 . Vergleich der Empfindlichkeit zwischen tragbaren PCR und eine konventionelle Lab basierende PCR. Quantifizierung des Erregers DNA erfolgte mittels unterschiedliche Mengen des Gens S. Subterranea ITS (106 bis 100 Exemplare) mit der SsTQ Primer/Sonde eingestellt. Lineare Regression zwischen Log-Wert S. Subterranea Plasmid DNA und Log Kehrwert der Cq auf den konventionellen Thermocycler (A) und der tragbaren Thermocycler (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 . Vergleich der Erkennungsleistung in künstlich verseuchten Böden mit S. Subterranea. Die Böden waren künstlich befallen (105 100 Sporosori/g Trockengewicht der Boden) mit S. Subterranea Sporosori Suspensionen. Mit der magnetischen Wulst-basierte Methode wurde DNA aus den befallenen Bodenproben gewonnen. PCRs wurden mit den Bodenproben mit dem SPO-Primer/Sonden-Set durchgeführt. Lineare Regression zwischen Log Wert ab Größe in Sporosori pro Gramm des Bodens und der gegenseitigen Log-Wert von Cq auf den konventionellen Thermocycler (A) und der tragbaren Thermocycler (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 . Vergleich der Menge von Bodenproben für DNA-Extraktion ab. Die magnetische Wulst-basierte Methode diente DNA-Extraktion von 10, 20, 50 und 100 mg von Bodenproben. Real-Time PCR wurden mit der tragbaren Thermocycler durchgeführt. Standardkurven repräsentieren die Beziehung zwischen der Höhe der Gesamt-DNA extrahiert aus den Bodenproben (x-Achse) und die Beträge der PCR-Produkt (y-Achse) verstärkt durch die Sss-Primer/Sonden-Set. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5 . Nachweis von anderen Krankheitserregern Kartoffel R. Solani und PMTV. Real-Time PCR wurden mit tragbaren Thermocycler und konventionellen Thermocycler durchgeführt. R. Solani AG3 wurde erkannt, in Gesamt-DNA extrahiert aus Reinkultur mit RsTq Primer und die RQP1 Sonde (A) PMTV in Gesamt-RNS extrahiert aus einem PMTV-infizierte Knolle Probe mit erkannt wurde, dass die PMTV-D Primer/Sonden (B) eingestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6 . Eine diagnostische Pipeline für phytopathogene. Flussdiagramm zeigt einen allgemeinen Workflow für also Diagnose. Beachten Sie, dass die traditionellen Schritt, z.B.visuelle Identifizierung weggelassen werden, kann wenn vor Ort molekulare Erkennung genutzt wird, die den gesamten Prozess der Diagnose schnell und einfach macht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Tragbare Real-Time PCR Real-Time PCR LAMPE ELISA Lateral-flow Kosten pro Ziel Reaktion $0,60-$8,47 $0,60 $0,75 $0,60 $4,74 Empfindlichkeit 100 Exemplare 10 Exemplare 10 Exemplare 1-10 Sporosori331-10 ng/mL (Protein)33 1-10 Sporosori345 x 105KBE/mL35 Zeit Kosten 90 Minuten 80-240 Minuten 50-90 Minuten32 3-24 Stunden 10-15 Minuten Vorbereitung erforderlich ●Nucleic sauren Extraktion● besser gekleideteres design ●Nucleic sauren Extraktion● Primer/Sonden design ● Nucelic sauren Extraktion● besser gekleideteres design ● Proteingewinnung● Antikörper N/A Andere Materialien erforderlich ● Tragbare thermocycler ● Konventionelle thermocycler ● colorimetrische Fleck● Inkubator ● Platte Leser● Waschanlagen N/A Tabelle 1. Vergleichende Tabelle der molekulare und serologische Nachweisverfahren für phytopathogene Grundierung Sequenz (5 ‘-3 ‘)eine Zielb SsTQ-F13 CCGGCAGACCCAAAACC ITS1-ITS2 in S. subterranea SsTQ-R13 CGGGCGTCACCCTTCA ITS1-ITS2 in S. subterranea SsTQ-P13 [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM] ITS1-ITS2 in S. subterranea Genesig S.subterranea Primer/Sonden N/A Aktin in S. subterranea SPO1014 GGTCGGTCCATGGCTTGA ITS in S. subterranea SPO1114 GGCACGCCAATGGTTAGAGA ITS in S. subterranea SPOPRO114 [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM] ITS in S. subterranea RsTqF119 AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT ITS1-ITS2 in R. solani RsTqR119 AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT ITS1-ITS2 in R. solani RQP119 [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM] ITS1-ITS2 in R. solani Genesig PMTV Primer/Sonden N/A CP-RT in PMTV PMTV-D-F-20 AGAATTGRCATCGAAACAGCA CP in PMTV PMTV-D-R20 GTCGCGCTCCAATTTCGTT CP in PMTV PMTV-D-P20 [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM] CP in PMTV ein Oligo DNA Zündkapseln wurden mit FAM (6-Carboxyfluorescein) oder TAM (5-Carboxytetramethylrhodamine) geändert. b ITS: Interne transkribierten Abstandhalter, CP: Beschichten Protein; CP-RT: Mantel Protein überlesen Tabelle 2. In dieser Studie verwendeten Primer Ergänzende Abbildung 1. Vergleich der DNA-Extraktionsmethoden für den Nachweis des Erregers pulvrige Schorf. Sechs verschiedene DNA-Extraktionsmethoden (A-F) wurden für den Nachweis des Erregers pulvrige Kruste, S. Subterranea in Bodenproben verglichen. (B, D, F). DNA mit Silica-basierten Kit #1 extrahiert wurde (siehe die Tabelle der Materialien für alle Kit-Namen), Silica-basierten Kit #2 und magnetischer Wulst-basierte Kit, steigen. PCR erfolgte mittels der konventionellen Lab basierende PCR Thermocycler. Standardkurven repräsentieren die Beziehung zwischen der Höhe der Gesamt-DNA extrahiert aus den Bodenproben und das PCR-Produkt durch den SsTQ Primer/Sonden Satz verstärkt. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden. Ergänzende Abbildung 2. Vergleich der Nachweisgrenze zwischen tragbaren PCR und eine konventionelle PCR Labor-basierte. Gesamt-DNA wurde aus einer Bodenprobe mit drei verschiedenen Extraktionsmethoden isoliert: (A, B) Doyle-Methode, (C, D) der Silica-basierten Kit #2, und (E, F) das magnetische Wulst-basierte Kit. Graphen dargestellt, auf der linken Seite Daten verwenden tragbare Thermocycler mit dem Sss-Primer/Sonden-Set, während die Diagramme auf der rechten Seite generierte SsTQ Primer/Sonden der konventionellen Labor-basierte Thermocycler mit Daten repräsentieren festgelegt. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.

Discussion

Wie in Tabelle 1dargestellt, haben die jüngsten technologischen Fortschritte in der molekularen Identifizierung von Krankheitserregern erhöht die Wirksamkeit, Präzision und Geschwindigkeit der Diagnose, die auf die Aufdeckung von präsymptomatischen Infektionen27beigetragen haben. Zur vor-Ort-Diagnose werden Lampe und Lateral-Flow-Methoden häufig verwendet, weil sie tragbar sind und sofortige Ergebnisse zu geringeren Kosten liefern. Jedoch kann artspezifische Erkennung bei serologischen Methoden schwer zu erreichen sein. Dies führt gelegentlich Richtungslogik Ziel Mikroben wie gemeinsamen Boden Einwohner. Zum Beispiel kann Kreuz Reaktivität zwischen den serologischen Tests von Phytophthora SPP und Pythium spp. im Falle der Kartoffel Krankheitserreger28, darauf hinweist, dass es manchmal Schwierigkeiten erkennen die gezielte Anlage Krankheitserregern.

In der vorliegenden Studie haben wir ein optimiertes Protokoll für vor-Ort-molekulare Erkennung von Kartoffel bodenbürtige Krankheitserreger mit dem tragbaren Echtzeit-PCR System durch einen Vergleich der Funktionen mit der einer konventionellen Labor-basierte Echtzeit-PCR-System entwickelt. Wir fanden, dass die vor-Ort-Methode speziell die Kartoffel-Erreger in der Bodenprobe erkennt, obwohl Empfindlichkeit ~ 10 Mal niedriger als die eine gleichwertige Lab basierende Assays ist. Es lohnt sich auch, wenn man bedenkt, dass in diesem Fall sowohl im Labor als auch im Bereich Test eine biologisch relevante Stichprobenumfang nicht genutzt haben. Große Stichproben sind erforderlich für den Einsatz in screening routinemäßig Bereich Böden als zuvor beschriebenen29,30, wo werden Stichproben von 250 g bis 1 kg verarbeitet, obwohl diese Methoden qualifiziertes Personal erfordern und anspruchsvoll, Ausrüstung, um DNA zu extrahieren. In der Regel ist ein groß angelegte Boden DNA extrahieren aus einer einzigen aggregierten Boden für zahlreiche Teilproben repräsentative 1 bis 4 ha6,29,30übernommen. Jedoch das Protokoll entwickelt, hier ist schnell, einfach zu bedienende für Benutzer ohne Vorkenntnisse in der molekularen Diagnostik und kann außerhalb eines Labors verwendet werden. Da die Methode schnell und relativ günstig im Vergleich zu großen Boden Extraktion ist, könnte es, viele kleine Proben aus einer ähnlichen Stichprobenraum, groß angelegte Sammelproben Bildschirm verwendet werden. Einige der Mängel von einer kleinen Stichprobe überwinden und zusätzliche Informationen über die räumliche Verteilung des Erregers im Feld bestimmen könnte. Darüber hinaus die Portabilität und die Geschwindigkeit der Methode bedeutet, dass es auch in Demonstrationsaktivitäten Züchter für verwendbar sind Bildungs- und Engagement-Zwecke.

Ein weiterer Aspekt ist, dass viele Echtzeit-PCR-Assays bereits für eine Vielzahl von pflanzlichen Krankheitserregern5veröffentlicht werden. Dieses System kann machen verwenden diese bestehenden Assays ohne die Notwendigkeit, um neue Lampe Zündkapseln in Feldtests aktivieren zu entwerfen. Eine häufige Kritik an der Lampe-Assays ist, dass sie schwer zu31design sein können. Tragbare PCR erlaubt daher die relativ einfache Implementierung einer breiten Palette von leicht verfügbaren Erreger Tests für die vor-Ort-Prüfung.

Traditionelle Methoden können oft kostspielig, mühsam, ungenau und zeitaufwändig sein. Die Einfachheit der vor-Ort-Methode, die wir entwickelt kann Züchter und Industriearbeiter Keimnachweis selbst durchführen und vielleicht viel schneller als das Senden an eine klinisch-diagnostische Laboratorium, das einiger Entfernung sein könnte ein Ergebnis zu erzeugen. Die Schnelligkeit und Sensibilität der tragbaren PCR-Methode können helfen, Züchter Potenzial zu vermeiden, die Sekundärinfektionen, die weiteren können der Erreger Bevölkerung und unbeabsichtigte Verbreitung (über Ausrüstung oder Menschen) zu erhöhen. Abschließend kann die vor-Ort-Methode entwickelt, die in der vorliegenden Studie relativ sensibel und präzise Erkennung von wichtig bodenbürtige Krankheitserreger im Feld. Unsere Hoffnung ist, dass die vor-Ort-Methode entwickelt, die in dieser Studie in einer aktuellen diagnostischen Pipeline (Abbildung 6), beiträgt, nicht nur durch die Bereitstellung von schneller und präzisen Antworten auf epidemiologische Fragen zu Pflanzenkrankheiten im Feld, sondern auch durch die Bereitstellung besseres Verständnis der Biologie und Epidemiologie der Pflanzenpathogene.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind dankbar, dass Dr. Neil C. Gudmestad an der North Dakota State University für die Bereitstellung von S. Subterranea Plasmid DNA, Dr. Hanu Pappu bei Washington State University (WSU) für die Bereitstellung von PMTV RNA und Dr. Debra Inglis am WSU für die Bereitstellung von R. Solani AG3. Besonderen Dank an Dr. Jeremy Jewell an WSU für Videografie Kommentare auf das Manuskript und die WSU CAHNRS Kommunikation vorsieht. Diese Forschung wurde unterstützt durch den Nordwesten Potato Research Consortium und der Washington State Department of Agriculture – Ernte Block Grant Themenprogramm (keine zu gewähren. K1764). PPNS Nr. 0741, Abteilung der Pflanzenpathologie, College of Agriculture, menschlichen und natürlichen Ressourcen Wissenschaften, landwirtschaftliche Forschungszentrum, Luke Projekt Nr. WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, USA.

Materials

White shell PCR plate Bio-Rad HSP9601
CFX Manager Bio-Rad 1845000
SsoAdvanced Universal Probes Supermix  Bio-Rad 1725280
CFX96 Touch qPCR instrument Bio-Rad  1855195
Ethylalcohol, pure 200 proof Decon Laboratories 04-355-222
Masterclear cap strips & real‑time PCR tube strips Eppendorf 9510222109
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Fisher BioReagents BP118-500
Phenol, Saturated  Fisher BioReagents BP1750I-400
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Fisher BioReagents BP152-5
q16 real-time PCR machine genesig MBS486001
Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Invitrogen 15525-017
2-Propanol (Isopropanol) JT Baker 67-63-0
Chloroform JT Baker 9180-03
Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) JT Baker 9535-03
iso-Amyl Alcohol JT Baker 9038-01
FastDNA Spin kit  MP Biomedicals 6560-200 Silica-based DNA extraction kit #1
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit New England Biolabs E3005S
0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes Phenix Research MPC-100LP
Easy DNA/RNA Extraction Kit  Primerdesign genesigEASY-EK
genesig Easy 1.5 mL tubes Primerdesign genesigEASY-1.5
Magnetic tube rack Primerdesign genesigEASY-MR
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit Primerdesign Path-S.subterranea-EASY
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H6269-100G
Pellet pestles Thermo Fisher Scientific 12-141-364
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific 7647-14-5
DNA Miniprep kit  ZymoBIOMICS D4300 Silica-based DNA extraction kit #2
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Riferimenti

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DeShields, J. B., Bomberger, R. A., Woodhall, J. W., Wheeler, D. L., Moroz, N., Johnson, D. A., Tanaka, K. On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System. J. Vis. Exp. (132), e56891, doi:10.3791/56891 (2018).
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