الكشف الجزيئي في الموقع من فيتوباثوجينس المنقولة بالتربة باستخدام نظام PCR الوقت الحقيقي المحمولة
Summary
الكشف السريع والدقيق لمسببات الأمراض النباتية في الموقع، ولا سيما المنقولة بالتربة مسببات، أمر حاسم لمنع المزيد من الإنتاج العدوى وانتشار الأمراض النباتية في الحقل. طريقة وضعها هنا باستخدام نظام الكشف عن PCR الوقت الحقيقي محمولة يمكن تشخيص الموقعي الظروف الميدانية.
Abstract
تشخيص الأمراض النباتية في الموقع يمكن أن يكون أداة مفيدة للمزارعين لاتخاذ قرارات في حينها التمكين من تنفيذ استراتيجيات إدارة الأمراض التي تقلل من أثر هذا المرض سابقا. حاليا في العديد من المختبرات التشخيصية، البلمرة المتسلسل (PCR)، بكر في الوقت الحقيقي وبخاصة، يعتبر الأسلوب الأكثر حساسة ودقيقة للكشف عن مسببات الأمراض النباتية. ومع ذلك، تقارير إتمام المشروعات المستندة إلى المختبر عادة ما تتطلب معدات المختبرات مكلفة والموظفين المهرة. في هذه الدراسة، ومسببات الأمراض المنقولة عن طريق التربة من البطاطا تستخدم لإثبات إمكانية الكشف الجزيئي في الموقع. وتحقق ذلك باستخدام بروتوكول سريعة وبسيطة تتألف من استخراج الحمض النووي القائم على حبة المغناطيسي، بكر المحمولة في الوقت الحقيقي (مقايسة على أساس التحقيق فلوروجينيك). مشجعا للغاية مقارنة بالنهج PCR المحمولة في الوقت الحقيقي مع نظام يستند إلى مختبر، الكشف عن عدد قليل من 100 نسخة من الحمض النووي من سوبتيرانيا سبونجوسبورا. طريقة PCR الوقت الحقيقي المحمولة المتقدمة هنا يمكن أن تخدم كبديل للنهج المستندة إلى المختبر وأداة مفيدة في الموقع لتشخيص الممرضات.
Introduction
التعريف الدقيق والسريع للعوامل الممرضة المسببة يؤثر إلى حد كبير اتخاذ القرارات المتعلقة بإدارة الأمراض النباتية. الأمراض المنقولة عن طريق التربة تتسم بصعوبة خاصة لتشخيص لأن بيئة التربة كبيرة للغاية بالنسبة إلى مصنع أسلحة، ومعقدة، مما يشكل تحديا لفهم جميع جوانب الأمراض المنقولة بالتربة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون الأمراض المنقولة عن طريق التربة كالكلاميديا خلال مراحل الإصابة الأولى، تعتمد على عوامل الإجهاد البيئي، وبعض فترات طويلة كامنة تؤدي إلى تأخر تشخيص1. وقد وضعت العديد من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق التربة هياكل البقاء على قيد الحياة، مثل جراثيم المتخصصة أو خيوط فطرية ميلانيزيد، الذي يمكن أن يعيش في التربة لسنوات عديدة حتى في غياب مضيفيهم. وتشمل النهج المستخدمة لإدارة الأمراض المنقولة عن طريق التربة: تجنب الحقول الموبوءة المعروفة واستخدام البذور المعتمدة خالية من مسببات الأمراض والشتلات وحفظ المعدات الصحية وتقييد حركة التربة والمياه عندما يكون ذلك ممكناً. المعرفة بوجود مسببات المرض من خلال استراتيجيات الكشف الجزيئي أيضا تلعب دوراً مفيداً بإبلاغ القرارات في الوقت المناسب فيما يتعلق بالعلاج في مرحلة مبكرة أو النباتات قبل تقييمات للحقول. الاختبار في الموقع توفر مزايا إضافية لتقديم نتيجة سريعة دون إرسال العينة إلى مختبر تشخيص أنه ربما بعض المسافة بعيداً وأيضا يمكن المشاركة الزارع إذا كان مثل هذا تشخيص بإجراء ‘حقل–الجانب’ في وجودها.
لتشخيص الموقعي استناداً إلى الكشف الجزيئي وحساسية وخصوصية، ومتانة (التكرار وإمكانية تكرار نتائج) والكفاءة (أي.، أداء البساطة والتكلفة) عوامل حاسمة للنظر فيها. الوحشي تدفق الأجهزة (Lfd) مثل إيمونوستريب وبوكيتدياجنوستيك، وأساليب شعبية للكشف عن العوامل الممرضة في الموقع بسبب بساطتها مقايسة خطوة واحدة. ومع ذلك، Lfd قد لا تكون أداة التشخيص الحق في جميع الحالات لأنها تفتقر إلى الحساسية والنوعية، ويوفر نتائج ملتبسة أحياناً إذا كان الممرض المستهدفة في تركيزات منخفضة ويمكن كروسريكت مع الأنواع المماثلة أو جنسا 2. التضخيم متحاور بوساطة حلقة (المصباح) ينطبق أيضا للكشف عن العوامل الممرضة في الموقع وغير مكلفة لا سيما سبب الكواشف منخفضة التكلفة، ورد فعل الظروف التي لا تزال مستمرة، وتحليل البصرية اللونية البسيطة. ومع ذلك، يتم عادة استخدام Lfd ومصباح على نوعيا، على الرغم من أن كلا النهجين يمكن أن تستخدم الكمية مع أكثر تكلفة المعدات3. البلمرة المتسلسل (PCR) يوفر خصوصية عالية وحساسية عالية، وقدرة على كمية بالمقارنة مع الأساليب المذكورة آنفا للكشف. مع ذلك، يتطلب تكنولوجيا PCR التقليدية المستندة إلى مختبر معدات المختبرات مكلفة والموظفين المهرة، والذي عيب رئيسي في اعتماد هذه التكنولوجيا كطريقة كشف لأغراض في الموقع.
ويتجلى في هذا البروتوكول، أسلوب تشخيص في الموقع باستخدام أداة PCR محمولة في الوقت الحقيقي. تكنولوجيا PCR الوقت الحقيقي يوفر مزايا أكثر من الأساليب الأخرى من حيث كمية الدقة والحساسية، وبراعة، وقد استخدمت على نطاق واسع للكشف عن مجموعة واسعة من النباتات المسببة للأمراض4،5، بما في ذلك مختلف البطاطا المسببة للأمراض في التربة6. بسبب الاتجاهات الأخيرة في سوق سريعة النمو والقدرة على المنافسة، واصلت المعدات المطلوبة لتقنية PCR تطويرها لتكون أكثر إيجازاً وأقل تكلفة7. البروتوكول يتكون من الخطوات التالية: استخراج الحمض النووي القائم على حبة المغناطيسية والمحمولة PCR الوقت الحقيقي (مقايسة على أساس التحقيق فلوروجينيك)، وتحليل البيانات الكمية التي يمكن أن كل شيء يتم عن بعد باستخدام كمبيوتر محمول (الشكل 1).
استخدام بروتوكول PCR المحمولة نمواً هنا، تم تحليل عينات التربة للكشف عن الممرضات المنقولة بالتربة، سوبتيرانيا سبونجوسبورا. واختير سبونجوسبورا كما ممرض بطاطا هامة كعامل سببية جرب مساحيق8. وفي العقود الأخيرة، يعتبر وجود هذا المرض قد انتشر إلى كثير من المناطق التي تزرع فيها البطاطا9،10. جرب مساحيق، من خلال وجود بثرة مثل الآفات على الدرنات يمكن أن يسبب خسائر كبيرة العائد النوعي لزارعي البطاطا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ناقل سوبتيرانيا س. البطاطا باتاكا أعلى الفيروسات (بمتف)، التي يمكن أن تسبب أعراض الآفة الداخلية في11،الدرنات (المعروفة باسم سبرينج)12. ولذلك، من المهم معرفة ما إذا كان حاضرا في الحقول قبل زراعة6 س. سوبتيرانيا . نحن أيضا إثبات جدوى هذا البروتوكول للكشف عن مرضى سولاني ملامسة المجموعة 3 (AG3) وبمتف. على الرغم من أن العديد من المجموعات ملامسة مرضى سولاني تسبب أمراضاً في البطاطس، AG3 هو يمكن القول أن الأكثر أهمية في العالم13، مما تسبب في وقف آفة والقشرة السوداء أسفر عن خسائر المحصول التسويقي لتصل إلى 30%14. بمتف يسبب آفات نخرية داخل الدرنات، التي تسمى عادة سبرينج. هذا الفيروس سجلت مؤخرا لأول مرة في العديد من الدول في شمال غرب المحيط الهادئ15،،من1617، وهو القلق المتزايد للمزارعين في هذه المنطقة تزايد أهمية البطاطس. بالإضافة إلى تحديد فعالية PCR المحمولة لهذه الأمراض الهامة، كما جرى التحقيق استخراج الحمض النووي الأمثل المنهجية والتربة حجم العينة في هذه الدراسة.
تشير النتائج إلى أن أسلوب PCR المحمول مرنة وقابلة للتطبيق للكشف عن مسببات الأمراض المختلفة. قمنا بتطوير طريقة الكشف في الموقع يمكن أن تسمح العاملين في خط المواجهة في الزراعة (الزراعمثلاً ) لاتخاذ القرارات السابقة المتعلقة بإدارة الأمراض، مثل تحديدات متنوعة أو التناوب، ويمكن تحديدها كمياً ممرض نبات في العينة وخلال دراسة استقصائية ميدانية، قبل الغرس، لتجنب احتمالات تفشي الأمراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما هو مبين في الجدول 1، والتطورات التكنولوجية الأخيرة في تحديد العوامل المسببة للأمراض الجزيئي زادت كفاءة ودقة، وسرعة التشخيص، مما أسهم في الكشف عن الالتهابات أعراض ما قبل27. وفيما يتعلق بتشخيص الموقعي، مصباح وأساليب التدفق الأفقي تستخدم بشكل متكرر لأنها قابلة للنقل وتقديم نتائج فورية بتكلفة أقل. ومع ذلك، في حالة الطرق المصلية، يمكن أن الكشف عن إبلاغها يصعب تحقيقه. ويؤدي ذلك أحياناً ميسديتيكشن للميكروبات خارج الهدف مثل سكان التربة المشتركة. على سبيل المثال، يمكن أن يكون هناك تفاعلية عبر بين الاختبارات المصلية لفحة spp. و Pythium spp. في حالة البطاطا مسببات الأمراض28، مما يشير إلى أن هناك في بعض الأحيان صعوبات في الكشف عن المصنع المستهدف مسببات الأمراض.
في هذه الدراسة، وقد وضعنا بروتوكولا أمثل للكشف الجزيئي في الموقع من مسببات الأمراض المنقولة بالتربة البطاطس باستخدام نظام PCR الوقت الحقيقي المحمولة بمقارنة قدراته مع ذلك التقليدية نظام PCR الوقت الحقيقي على المعمل. ووجدنا أن الأسلوب في الموقع على وجه التحديد الكشف عن مسببات الأمراض البطاطا في عينة التربة، على الرغم من حساسية ~ 10 مرات أقل من تلك ما يعادل المقايسة المستندة إلى مختبر. كما أنها جديرة بالنظر فيها أن التجارب المختبرية والميدانية على حد سواء لا تستخدم في هذه الحالة حجم عينة البيولوجية ذات صلة. أحجام عينات كبيرة مطلوبة لاستخدامه في الفرز بشكل روتيني تربة الحقل كما هو موضح سابقا29،30، حيث تتم معالجة أحجام العينة من بين 250 غرام إلى 1 كغم، على الرغم من أن هذه الأساليب تتطلب المشغلين المهرة ومتطورة معدات لاستخراج الحمض النووي. عادة، تربة على نطاق واسع استخراج الحمض النووي مأخوذ من عينة تربة تجميعية واحد ممثل عنها العديد عبر هكتار 1 إلى 46،،من2930. ومع ذلك، البروتوكول وضع هنا هو سريعة وسهلة الاستخدام للمستخدمين مع عدم وجود خبرة سابقة في التشخيص الجزيئي ويمكن استخدامها خارج مختبر. كما الطريقة سريعة ورخيصة نسبيا مقارنة باستخراج التربة على نطاق واسع، ويمكن استخدامه للشاشة العديد من عينات صغيرة مأخوذة من منطقة مماثلة لأخذ عينات لعينات الكلي على نطاق واسع. هذا يمكن التغلب على بعض أوجه القصور في حجم عينة صغيرة وتحديد معلومات إضافية حول التوزيع المكاني لمسببات المرض في الحقل. وباﻹضافة إلى ذلك، قابلية وسرعة من الطريقة يعني أنه يمكن أيضا استخدامه في أنشطة البيان العملي للمزارعين للتعليم وأغراض المشاركة.
وهناك اعتبار آخر أن العديد من فحوصات PCR الوقت الحقيقي فعلا تنشر لمجموعة واسعة من مسببات أمراض النبات5. ويمكن جعل هذا النظام استخدام هذه الاختبارات الموجودة دون الحاجة لتصميم كبسولة تفجير مصباح جديد لتمكين في الاختبار الميداني. انتقادات متكررة لفحوصات مصباح أنها يمكن أن يكون من الصعب على تصميم31. ولذلك، يسمح PCR المحمولة، تنفيذ مجموعة واسعة من الاختبارات الممرض متاحة بسهولة للاختبار في الموقع سهلة نسبيا.
يمكن أن تكون الأساليب التقليدية غالباً ما مكلفة وشاقة وغير دقيقة، وتستغرق وقتاً طويلاً. بساطة الأسلوب في الموقع الذي وضعنا يسمح لمزارعي وعمال الصناعة القيام بالكشف عن العوامل الممرضة بأنفسهم وربما تولد نتيجة أسرع بكثير من إرسال إلى مختبر تشخيص التي يمكن أن تكون بعض المسافة بعيداً. سرعة وحساسية لأسلوب PCR المحمولة يمكن أن تساعد المزارعين تجنب احتمال العدوى الثانوية، التي يمكن أن تزيد زيادة السكان الممرض وانتشار غير مقصودة (عن طريق المعدات أو البشر). وفي الختام، الأسلوب في الموقع الذي وضعت في هذه الدراسة تمكن من كشف دقيقة وحساسة نسبيا هام مسببات الأمراض المنقولة بالتربة في الحقل. وأملنا أن الأسلوب في الموقع الذي وضعت في هذه الدراسة ستسهم في توجيه تشخيص الحالية (الشكل 6)، ليس فقط بتوفير إجابات سريعة ودقيقة للأسئلة الوبائية عن الأمراض النباتية في الحقل ولكن أيضا بتوفير زيادة فهم علم الأحياء وعلم الأوبئة لمسببات الأمراض النباتية.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لنيل الدكتور جيم جودميستاد في “جامعة ولاية داكوتا الشمالية” لتوفير سوبتيرانيا S. بلازميد الحمض النووي، الدكتور هانو Pappu في جامعة الدولة واشنطن (WSU) لتوفير “بمتف الجيش الملكي النيبالي”، والدكتورة ديبرا أنجليس في WSU لتوفير سولاني ر. AG3. شكر خاص إلى الدكتور جيريمي وجويل في WSU لتقديم تعليقات على المخطوط والاتصالات كاهنرس WSU للفيديو. هذا البحث ودعم اتحاد البحوث البطاطا شمال غرب وواشنطن الدولة وزارة الزراعة-برنامج منح كتلة المحاصيل المتخصصة (منحة لا. K1764). بنس رقم 0741، علم الأمراض قسم النبات، كلية الزراعة، وعلوم الموارد البشرية والطبيعية، ومركز البحوث الزراعية، رقم المشروع هاتش WNP00833، جامعة ولاية واشنطن، بولمان، واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
| SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
| CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
| Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| Masterclear cap strips & real‑time PCR tube strips | Eppendorf | 9510222109 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
| Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
| q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
| Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
| iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
| FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
| Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
| 0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
| Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
| genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
| Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
| Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
| Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |
Riferimenti
- Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. d. e. l. M. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
- Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
- Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
- Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
- Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
- Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato – a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
- Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
- Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
- Jones, R. a. C., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
- Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
- Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
- Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
- Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
- Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
- Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
- Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
- Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
- Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
- van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
- Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
- Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
- Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
- Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
- Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
- Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
- Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
- Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
- Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
- Narayanasamy, P. . Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , (2016).
- Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).
