Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage
Summary
Régulation traductionnelle joue un rôle important dans le contrôle de l’abondance de la protéine. Nous décrivons ici une méthode de haut débit pour l’analyse quantitative de la traduction dans la levure Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Traduction de l’ARNm en protéines est un processus complexe impliquant plusieurs couches du règlement. Il est souvent supposé que les modifications dans la transcription de l’ARNm reflètent les changements dans la synthèse des protéines, mais beaucoup d’exceptions ont été observés. Récemment, une technique appelée ribosome profilage (ou Ribo-Seq) est devenue une méthode puissante qui permet d’identifier, avec précision, quelles régions de l’ARNm sont traduites en protéines et la quantification de la traduction à l’échelle du génome. Nous présentons ici un protocole généralisé pour la quantification de tout le génome de la traduction à l’aide de Ribo-Seq dans la levure de bière. En outre, combinant les données de Ribo-Seq avec les mesures d’abondance ARNm permet simultanément de quantifier l’efficacité traduction de milliers de transcriptions d’ARNm dans le même échantillon et comparer les variations de ces paramètres en réponse à l’expérimental manipulations ou dans différents États physiologiques. Les auteurs décrivent un protocole détaillé de génération d’empreintes de pas de ribosome à l’aide la digestion nucléasique, isolement des complexes ribosome intact-empreinte par fractionnement de gradients de sucrose et préparation des bibliothèques d’ADN pour le séquençage en profondeur ainsi qu’il est approprié contrôles de qualité nécessaires pour une analyse précise de la traduction de in vivo .
Introduction
traduction de l’ARNm est un processus fondamentales dans la cellule, qui joue un rôle important dans la régulation de l’expression de la protéine. Par conséquent, la traduction de l’ARNm est étroitement contrôlée en réponse à différents stimuli physiologiques internes et externes 1,2. Cependant, les mécanismes de régulation traductionnelle demeurent peu étudiées. Nous décrivons ici le protocole pour la quantification du génome entier de traduction dans la levure de bière par profilage du ribosome. L’objectif global de la technique de profilage de ribosome est d’étudier et de quantifier la traduction des ARNm spécifiques dans des conditions cellulaires différentes. Cette technique utilise le séquençage de la prochaine génération d’analyser quantitativement occupation ribosome dans tout le génome et permet de contrôler le taux de protéine synthèse in vivo au codon unique résolution 3,4. Actuellement, cette méthode fournit les moyens de mesurer les niveaux de la traduction des protéines les plus avancées et s’est avéré pour être un outil de découverte utiles fournissant des informations qui ne peuvent être révélées par d’autres techniques actuellement disponibles, p. ex. puces ou traduction état Tableau analyse (TSAA) 5. Ribosome profilage des rapports sur l’évolution combinée des niveaux de transcription et sortie translationnelle, il apporte aussi beaucoup plus grande sensibilité par rapport aux autres méthodes.
Cette approche est basée sur le séquençage en profondeur du ribosome-protégé de fragments de mRNA 3. Au cours de la traduction des protéines, protègent les ribosomes ~ 28 portions de nt de l’ ARNm (appelé empreintes) 6. En déterminant la séquence des fragments protégé par ribosome, Ribo-Seq peut carte la position des ribosomes sur l’ARNm traduits et identifier quelles régions de l’ARNm sont susceptibles d’être activement traduit en protéine 3,7. En outre, nous pouvons mesurer quantitativement la traduction des ARNm en comptant le nombre d’empreintes de pas qui s’harmonisent à une transcription ARNm donnée.
Afin d’isoler les fragments protégé par ribosome, lysats cellulaires sont initialement traités avec un inhibiteur de la traduction à caler les ribosomes suivies par digestion de ribonucléase. Considérant que la libre ARNm et les portions des ARNm traduit ne pas protégés par les ribosomes sont dégradées par la ribonucléase, les fragments d’ADN messagère ribosome protégé peuvent être récupérés par purifiant complexes ribosome intact-empreinte. Ces empreintes d’ARNm sont ensuite convertis en ADNc et analysés par séquençage en profondeur (Figure 1). En parallèle aux ribosomes de profilage, ARNm intacte est extraite à partir du même échantillon et séquencé. En comparant le volume de traduction identifiée par Ribo-Seq avec les mesures d’abondance ARNm, nous pouvons identifier les gènes qui sont spécifiquement ou down-régulation au niveau de la traduction et calculer l’efficacité de la traduction de l’ARNm à l’échelle du génome. Alors que le protocole décrit dans cet article est spécifique pour la levure, il devrait être aussi utile pour les chercheurs qui vont tenter d’établir le protocole de Ribo-Seq dans d’autres systèmes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approche de Ribo-Seq est devenue une technologie puissante pour l’analyse de l’ARNm traduction in vivo à l’échelle du génome niveau 3. Des études utilisant cette approche, qui permet de contrôler la traduction avec une résolution unique-codon, a contribué à notre compréhension de la régulation traductionnelle. Malgré ses avantages, Ribo-Seq présente plusieurs limites. Fragments d’ARN ribosomal (ARNr) sont toujours co purifiés lors de l’isolation des empreintes p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions AG040191 et AG054566 à VML. Cette recherche a été menée alors que VML est un bénéficiaire d’une subvention de recherche AFAR de l’American Federation for Aging Research.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
Riferimenti
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