على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم
Summary
تنظيم متعدية الجنسيات دوراً هاما في السيطرة على وفرة البروتين. هنا، يمكننا وصف أسلوب الفائق للتحليل الكمي للترجمة في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
ترجمة مرناً إلى البروتينات عملية معقدة تنطوي على عدة طبقات من اللائحة. كثيرا ما يفترض أن تعكس التغييرات في النسخ مرناً التغييرات في تخليق البروتين، ولكن الكثير من الاستثناءات قد لوحظت. في الآونة الأخيرة، برزت تقنية تسمى الريبوسوم التنميط (أو Seq ريبو) كطريقة قوية تتيح تحديد الهوية، مع درجة عالية من الدقة، أي مناطق مرناً يتم ترجمتها إلى بروتينات والتحديد الكمي للترجمة على مستوى المنظومة الجينوم. نقدم هنا، بروتوكول معممة على نطاق الجينوم التقدير الكمي للترجمة باستخدام Seq ريبو في مهدها الخميرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الجمع بين البيانات ريبو-Seq مع قياسات الوفرة مرناً يسمح لنا بقياس كفاءة الترجمة الآلاف من النصوص مرناً في نفس العينة في وقت واحد، ومقارنة التغيرات في هذه المعلمات في الاستجابة إلى تجريبية التلاعب أو في حالات فسيولوجية مختلفة. يصف لنا بروتوكول مفصل لجيل أقدام الريبوسوم باستخدام نوكلاس الهضم، عزل مجمعات البصمة الريبوسوم سليمة عن طريق تجزئة السكروز التدرج، وإعداد مكتبات الحمض النووي لتسلسل العميقة جنبا إلى جنب مع المناسبة نوعية الضوابط اللازمة لضمان دقة التحليل في فيفو الترجمة.
Introduction
الترجمة مرناً هو إحدى العمليات الأساسية في الخلية، والتي تلعب دوراً هاما في تنظيم التعبير البروتين. ولذلك، الترجمة مرناً مراقبة شديدة واستجابة لمختلف المحفزات الفسيولوجية الداخلية والخارجية 1،2. ومع ذلك، تظل آليات التنظيم متعدية المداريين. هنا، نحن تصف البروتوكول للتحديد الكمي للترجمة في مهدها الخميرة على نطاق الجينوم بالتنميط الريبوسوم. والهدف العام لأسلوب التنميط الريبوسوم هو دراسة وتحديد مقدار ترجمة مرناس محددة تحت ظروف مختلفة الخلوية. هذا الأسلوب يستخدم التسلسل الجيل القادم لتحليل كمي شغل الريبوسوم في جميع أنحاء الجينوم ويتيح رصد معدل البروتين التوليف في فيفو كودون واحد القرار 3،4. حاليا، هذا الأسلوب يوفر الوسائل الأكثر تقدما لقياس مستويات البروتين الترجمة، وقد ثبت أن تكون أداة اكتشاف مفيدة توفر معلومات يمكن الكشف عنها بغيرها من التقنيات المتوفرة حاليا، مثل [ميكروارس] أو ترجمة الدولة مصفوفة تحليل (تسا) 5. الريبوسوم التنميط تقارير عن التغيرات مجتمعة في مستويات النص والإخراج متعدية الجنسيات، كما أنه يوفر الكثير من حساسية أكبر مقارنة بالأساليب الأخرى.
يقوم هذا النهج على تسلسل العميقة المحمية الريبوسوم مرناً شظايا 3. أثناء ترجمة البروتين، حماية ريبوسوم ~ 28 nt أجزاء من مرناً (تسمى أقدام) 6. قبل تحديد تسلسل أجزاء محمية الريبوسوم، يمكن تعيين موضع ريبوسوم في مرناً المترجمة Seq ريبو وتحديد المناطق التي من مرناً يرجح أن تترجم بنشاط البروتين 3،7. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن نقيس الكمية ترجمة مرناً بإحصاء عدد المسارات التي تتوافق مع نسخة مرناً معين.
بغية عزل الأجزاء المحمية الريبوسوم، تعامل ليساتيس خلية في البداية مع مثبط ترجمة إلى المماطلة ريبوسوم تليها الهضم ريبونوكليسي. بينما هي أفسدتها الحرة مرناً وأجزاء من مرناس المترجمة التي لا تحميها ريبوسوم ribonuclease، يمكن استرداد الشظايا مرناً محمية الريبوسوم بتنقية مجمعات البصمة الريبوسوم سليمة. هذه آثار أقدام مرناً ثم تحويلها إلى مكتبة كدنا وتحليلها بواسطة تسلسل العميق (الشكل 1). وبالتوازي مع الريبوسوم التنميط، المستخرجة من نفس العينة سليمة مرناً ومتسلسلة. بمقارنة مستوى الترجمة التي حددها ريبو-Seq مع قياسات الوفرة مرناً، يمكننا تحديد الجينات التي هي على وجه التحديد أعلى أو أسفل-التنظيم على مستوى الترجمة وحساب كفاءة الترجمة مرناً على مستوى المنظومة الجينوم. بينما البروتوكول الموصوفة في هذه المقالة محددة للخميرة، ينبغي أيضا مفيدة للباحثين الذين سيحاولون وضع البروتوكول ريبو-Seq في النظم الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
النهج Seq ريبو الذي برز كتقنية قوية لتحليل مرناً الترجمة في فيفو على نطاق الجينوم المستوى 3. الدراسات باستخدام هذا النهج، الذي يسمح برصد الترجمة مع القرار كودون واحد، قد ساهم في فهمنا للتنظيم متعدية الجنسيات. وعلى الرغم من مزاياه، Seq ريبو نقائص عديدة. شظايا الريباسي الحمض ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح AG040191 و AG054566 على VML. أجرى هذا البحث في حين كان VML مستلم عفر “منحة بحثية” من “الاتحاد الأمريكي” “بحوث الشيخوخة”.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
Riferimenti
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3′ untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O’Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
