Summary

마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법

Published: March 19, 2018
doi:

Summary

이 프로토콜에는 혈액에서 오염 없이와 뇌 척추 액체 (CSF)의 풍부한 컬렉션에 대 한 향상 된 기술을 설명합니다. 큰 샘플 수집 및 순수성, 더 많은 분석 두뇌 및 척수에 영향을 질병의 우리의 이해를 추가 CSF를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

Abstract

뇌 척추 액체 (CSF) 분석 신경 과학 연구에 대 한 귀중 한 체액 이다. 그것은 중앙 신 경계와 가까운 접촉에서 체액 중 하나입니다 하 고 따라서,이 조직에 직접 액세스 하지 않고 뇌 또는 척수의 병 상태를 분석에 사용할 수 있습니다. 그러나, 쥐 혈관의 친밀감 때문 시스테 마그나에서 얻기 어렵다,이 종종 샘플 오염. 마우스에 CSF 컬렉션에 대 한 지역에 해 부도 어렵습니다 그리고 종종 작은 샘플 (5-7 µ L의 최대 또는 더 적은) 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 자세하게에서 혈액 오염 최소화 (평균 10-15 µ L를 수집할 수 있습니다)에 CSF의 풍부한 컬렉션에 대 한 허용 하는 컬렉션의 현재 방법에 향상 하는 기술을 설명 합니다. 이 기술은 그것 CSF 추출 하는 동안 모든 조직에 영향을 하지 않습니다 마우스에서 조직 컬렉션에 대 한 다른 해 부 방법으로 사용할 수 있습니다. 따라서, 뇌와 척수가이 기법으로 영향을 받지 않습니다 하 고 그대로 유지. 큰 CSF 샘플 수집 및 순수성, 더 많은 분석이 더 액체 보조 신경 과학 연구에 사용할 수와 더 나은 두뇌 및 척수에 영향을 미치는 질병을 이해.

Introduction

CSF 분석 신경 과학 연구에 대 한 귀중 한 체액 이다. CSF는 주로, (아니 붉은 혈액 세포와만 몇 백혈구) 몇 셀을 포함 하 고는 거의 단백질-무료. 그것 하나는 체액의 중앙 신경 시스템 (CNS)와 가까이 접촉에서 이며 전달할 수 많은 전해질 밖으로 두뇌 및 척수 주변 시스템을. 인간에서는, CSF 샘플 수집 질병 진단에 도움이 될 수 있습니다 또는 임상 시험에서 연구 목적, 척추 수돗물 (또는 요 추 찔린)으로 사소한, 침략 적 절차: CSF 액체가에 직접 액세스 하지 않고 CNS에 변화를 반영할 수 있다 조직입니다. 따라서, 병원, 연구 목적을 위해 최근 몇 년 동안에서 CSF 샘플 Alzheimer의 질병, 다른 치 매1,2,3같은 신경 퇴행 성 질환의 환자에서 얻이 되었습니다. 많은 잠재적으로 클리닉2,3에서 질병 진단에 도움이 CSF 샘플을 사용 하 여 개발 된 바이오 마커 분석 실험을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 구체적으로 진단 질병4,5일관성, 민감한 결과를 이러한 분석의 신뢰성에 많은 논쟁이 있다. 그래서, 큰 감도와 특이성 신경 퇴행 성 질환을 진단 하는 표준 기술을 생산에 도움이 더 나은 분석 및 목표, CSF에서 찾을 수 있습니다, 개발에 대 한 중대 한 필요가 있다. 질병에서 인간 CSF 샘플의 잠재적인 중요성 때문 신경 과학 연구에 설치류에서 CSF의 컬렉션의 관심 이기도합니다.

마우스 생물학과 의학 연구에 중요 한 동물 고 잠재적 치료 화합물 및 인간 임상 시험 전에 개념 증명 연구의 테스트에 대 한 허용 한다. 그러나, 쥐에서 어렵습니다 작은 동물, 뇌의 친밀감 때문에 CSF 샘플을 얻기 위해 생쥐에서 CSF 컬렉션의 일반적인 방법은 시스테 마그나, 소 뇌 수 질 oblongata의 등 쪽 표면 사이 개통을 통해 그것을 얻을 하는 것입니다. 어려움으로이 지역에 해 부 어렵다 CSF 샘플을 수집 하 고 혈관, 혈액 세포에서 오염의 위험이 증가에 가까운 근접에서 발생 합니다. 이러한 어려움 때문에 대부분 연구자만 분석 (일반적으로 5-7 µ L로 명시 된)에 대 한 CSF의 작은 금액을 가져올 수 있습니다 및 혈액 세포에 의해 CSF 견본의 오염 분석6,,78 에 대 한 주요 관심사는 , 9. 혈액 오염 결과 보이지 않게 수 고 하지 진정으로 CNS의 상태를 반영. 쥐에서 수집 된 일반적인 금액으로 충분 한 측정 (또는 3 중) 제한 된 샘플 수집 연구를 충격 하는 또한, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)을 사용 하 여. 따라서, CSF 샘플 충분 한 샘플을 여러 분석 실험을 실행 하기 위해 여러 마우스에서 일반적으로 풀링됩니다. 풍부한에 대 한 프로토콜을 개발, 쥐에서 CSF의 오염의 컬렉션은 크게 원하는 하 고 설치류를 사용 하 여 신경 과학 연구를 개선에 도움이 될 것입니다.

이 프로토콜, 풍부한 기술 (평균 10-15 µ L) 마 취 쥐에서 CSF의 컬렉션 자세히 설명 하 고 피10에서 오염을 최소화 하기 위해 CSF 컬렉션의 현재 알려진된 방법에 향상. CSF 컬렉션에 대 한 강력한 프로토콜 CSF 기반 바이오 마커 분석, 질병 진단에 도움이 CNS에 영향을 미치는 질병의 기반이 되는 메커니즘을 연구 개선 하는 데 사용 수의 개발에 도움이 됩니다.

Protocol

모든 동물 실험 신경 과학 (미국), 복 단 대학 (상하이, 중국) 윤리 위원회에 대 한 협회의 정책에 따라 수행 했다. 이 절차는 비 생존 수술입니다. 1입니다. CSF 컬렉션 장치 설치 유리 모 세관 당겨 (내경 0.75 m m, 외부 직경 1.0 m m) 같이 사용 하는 micropipette 끌어당기는 사람 (리 우 외. 10; 날카롭게 모 세관에에서 표시 됩니다 그림 1</s…

Representative Results

(그림 1 및 그림 2) 여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, 모 세관에 즉시 수집 CSF 클리어 (그림 2E), 분홍색 또는 빨간색 이어야 한다. 액체는 모 세관에서 수집에 붉은 가미에 분홍색 경우 혈액으로 오염이 했다. CSF 샘플의 응용 프로그램의 예를 들어가이 방법으로…

Discussion

이 프로토콜 설명 자세히 혈액 오염 최소화 및 CSF의 풍부한 컬렉션에 대 한 허용 CSF 컬렉션의 현재 방법10 에 향상 (평균 ~ 10-15 µ L를 얻을 수 있다) 쥐에서. 모 세관 끝을 깨는, 모 세관의 끝 해서는 안됩니다 (그럼 CSF 추출 됩니다 매우 느리게) 너무 작은 또는 너무 큰 (되지 않습니다 CSF 수집을 충분히 잘 하 고 조직 모 세관에서 제기 될 수 있다). 주의 해야 때 CSF 컬렉션에 대 한 영…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81650110527, 81371400)와 키 기본 연구 프로그램의 중국 국가 (2013CB530900)에 의해 지원 되었다.

Materials

Chloral hydrate (used as anesthetic) Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. 30037517 CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors 66 vision technology 54002
Dissecting curved forceps 66 vision technology 53072
Dissecting straight forceps 66 vision technology 53070
Mouse adapter (with ear bars) Made in-house. N/A Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope Meiji Labax Model 15381
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Magnetic base for micromanipulator Kanetec MB-K
Glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-1000
Syringes (1ml) Tansoole 02024692 For 1ml.
Microtubes (1.5ml) Axygen MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free Calbiochem 539134
Human Aβ42 ELISA kit Invitrogen KHB3441
Piping (teflon tubing) World Precision Instruments MMP-KIT Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge Tiangen Biotech OSE-MC8
Cotton buds Obtained from any household store/pharmacy. N/A

Riferimenti

  1. Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer’s Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
  2. Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
  3. Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
  4. Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer’s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer’s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer’s Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
  5. Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer’s disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
  6. Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
  7. Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
  8. Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer’s Dement. , (2016).
  9. You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
  10. Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
  11. Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
  12. Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).

Play Video

Citazione di questo articolo
Lim, N. K., Moestrup, V., Zhang, X., Wang, W., Møller, A., Huang, F. An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice. J. Vis. Exp. (133), e56774, doi:10.3791/56774 (2018).

View Video