Un metodo migliore per la raccolta di liquido cerebrospinale da topi anestetizzati
Summary
Questo protocollo descrive una tecnica migliore per la raccolta abbondante di liquido cerebrospinale (CSF) senza contaminazione da sangue. Con una maggiore raccolta di campioni e purezza, altre analisi possono essere eseguite utilizzando CSF per avanzare la nostra comprensione delle malattie che colpiscono il cervello e il midollo spinale.
Abstract
Il liquido cerebrospinale (CSF) è un prezioso fluido corpo per analisi in ricerca in neuroscienza. È uno dei fluidi in più stretto contatto con il sistema nervoso centrale così, può essere utilizzato per analizzare lo stato di malato del cervello o del midollo spinale senza accedere direttamente a questi tessuti. Tuttavia, nei topi che è difficile da ottenere dalla cisterna magna grazie alla sua vicinanza ai vasi sanguigni, che spesso contaminare i campioni. La zona per accumulazione di CSF in topi è anche difficile da sezionare per e spesso solo piccoli campioni sono ottenuti (massimo di 5-7 µ l o meno). Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica che migliora sugli attuali metodi di raccolta per minimizzare la contaminazione da sangue e consentire la raccolta abbondante di CSF (in media che 10-15 µ l possono essere raccolti). Questa tecnica può essere utilizzata con altri metodi di dissezione per raccolta di tessuto dai topi, come non impatto eventuali tessuti durante l’estrazione di CSF. Così, il cervello e il midollo spinale non sono interessati con questa tecnica e rimangono intatti. Con una maggiore raccolta di campioni di CSF e purezza, ulteriori analisi possono essere utilizzati con questa ricerca in neuroscienza fluido ad ulteriori aiuti e comprendere meglio le malattie che colpiscono il cervello e il midollo spinale.
Introduction
Il CSF è un prezioso fluido corpo per analisi in ricerca in neuroscienza. Il CSF è principalmente fatta da plasma sanguigno, contenente alcune cellule (non di globuli rossi e pochi globuli bianchi) ed è quasi privo di proteine. È uno dei fluidi a stretto contatto con il sistema nervoso centrale (SNC) e può passare molti elettroliti dal cervello e il midollo spinale al sistema periferico. In esseri umani, i campioni di CSF possono essere raccolti per aiutare nella diagnosi di malattia o per scopi di ricerca negli studi clinici, come una puntura lombare (o puntura lombare) è una procedura invasiva, minore: il fluido di CSF può riflettere le modifiche nel SNC senza dover accedere direttamente a queste tessuti. Così, negli ultimi anni, per scopi di ricerca in clinica, i campioni di CSF sono stati ottenuti da pazienti di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e altre demenze1,2,3. Ci sono molti saggi di biomarcatore che sono stati sviluppati utilizzando campioni di liquor per potenzialmente diagnosticare malattie in clinica2,3. Tuttavia, c’è molto dibattito sull’affidabilità di questi test per produrre risultati coerenti e sensibili per specificamente diagnosticare malattia4,5. Così, c’è un grande bisogno per lo sviluppo migliore nei test di obiettivi, che possono essere trovati nel CSF, per aiutare nella produzione di una tecnica standard per diagnosticare malattie neurodegenerative con maggiore sensibilità e specificità. A causa dell’importanza potenziale di campioni di CSF umano nella malattia, la collezione di CSF dai roditori in ricerca in neuroscienza è anche di interesse.
I topi sono animali importanti nella ricerca biologica e medica e consentono per la prova dei composti terapeutici potenziali e studi di prova prima di test clinici umani. Tuttavia, nei topi è difficile ottenere campioni di CSF grazie alla sua vicinanza al cervello in un piccolo animale, come il metodo usuale di accumulazione di CSF in topi è ottenerlo via della cisterna, un’apertura tra il cervelletto e superficie dorsale del oblongata del midollo. Questo provoca difficoltà nella raccolta dei campioni di CSF come questa zona è difficile da sezionare per e in prossimità di vasi sanguigni, aumentando il rischio di contaminazione da parte di cellule del sangue. A causa di queste difficoltà, la maggior parte dei ricercatori possono ottenere solo una piccola quantità di CSF per analisi (solitamente indicato come µ l 5-7) e la contaminazione dei campioni di CSF dalle cellule del sangue è una preoccupazione primaria per analisi6,7,8 , 9. contaminazione sanguigna può oscurare i risultati e non veramente riflettere lo stato del SNC. Inoltre, limitato campione raccolto può influire la ricerca come la solita quantità raccolte da topi è sufficiente per la sola misura (in doppio o triplice copia) utilizzando analisi enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA). Così, campioni di liquor sono solitamente in pool da topi multipli al fine di avere abbastanza campione per eseguire saggi multipli. Sviluppo di un protocollo per l’abbondante, collezione incontaminato di CSF dai topi è fortemente desiderato e sarà utile nel miglioramento della ricerca neuroscientifica utilizzando roditori.
In questo protocollo, una tecnica per l’abbondante (una media di 10-15 µ l) insieme di CSF da topi anestetizzati è descritta dettagliatamente e migliora il metodo attualmente conosciuto di accumulazione di CSF per minimizzare la contaminazione da sangue10. Un protocollo robusto per accumulazione di CSF sarà di aiuto nello sviluppo di analisi di biomarker basati su CSF, che potrebbero essere utilizzati per diagnosticare la malattia, come pure di migliorare la ricerca dei meccanismi che sono alla base di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica che migliora il corrente metodi10 di accumulazione di CSF per minimizzare la contaminazione da sangue e consentire la raccolta abbondante di CSF (in media ~ 10-15 µ l può essere ottenuta) dai topi. Rompendosi la punta capillare, la punta del capillare non deve essere troppo piccola (è come allora verranno estratti molto lentamente il CSF) o troppo grande (non sarà abbastanza per raccogliere il CSF bello e tessuto può rimanere incastrato nel …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation of China (81650110527, 81371400) e nazionali chiave base ricerca programma della Cina (2013CB530900).
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
Riferimenti
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