Une méthode améliorée pour la collecte du liquide céphalo-rachidien de souris anesthésiés
Summary
Ce protocole décrit une technique améliorée pour la collection abondante de liquide céphalo-rachidien (LCR) sans la contamination du sang. Avec une plus grande collecte d’échantillons et de la pureté, des analyses plus peuvent être effectuées à l’aide de CSF pour faire avancer notre compréhension des maladies qui affectent le cerveau et la moelle épinière.
Abstract
Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un liquide organique précieux pour l’analyse de la recherche en neurosciences. Il est l’un des fluides en contact plus proche avec le système nerveux central et ainsi, peut être utilisé pour analyser l’État malade du cerveau ou la moelle épinière sans accéder directement à ces tissus. Cependant, chez les souris, qu’il est difficile d’obtenir de la magna de cisterna en raison de sa proximité aux vaisseaux sanguins, qui contaminent souvent échantillons. La zone pour collection CSF chez la souris est aussi difficile à décortiquer à et souvent seulement de petits échantillons sont obtenus (maximum de 5-7 µL ou moins). Ce protocole décrit en détail une technique qui améliore les méthodes actuelles de collecte pour minimiser la contamination du sang et permettre la collection abondante du LCR (en moyenne que 10-15 µL peuvent être collectées). Cette technique peut servir à d’autres méthodes de dissection pour la collection de tissus provenant de souris, car il n’influe pas sur les tissus lors de l’extraction de la CSF. Ainsi, le cerveau et la moelle épinière ne sont pas affectés par cette technique et restent intacts. Avec une plus grande collecte d’échantillons de CSF et pureté, des analyses plus peuvent être utilisés avec ce fluide d’autre aide la recherche en neurosciences et mieux comprennent les maladies qui touchent le cerveau et la moelle épinière.
Introduction
Le CSF est un liquide organique précieux pour l’analyse de la recherche en neurosciences. Le CSF est principalement fabriqué à partir de plasma sanguin, contenant peu de cellules (sans culots globulaires et seulement quelques cellules de sang blanches) et est presque exempt de protéines. C’est l’un des fluides en contact étroit avec le système nerveux central (CNS) et il peut passer des électrolytes beaucoup du cerveau et la moelle épinière vers le système périphérique. Chez l’homme, échantillons de LCR peuvent être recueillis pour aider à diagnostiquer la maladie ou à des fins de recherche dans les essais cliniques, comme une ponction lombaire (ou ponction lombaire) est une procédure invasive mineure : le fluide de CSF peut refléter des changements dans le système nerveux central sans avoir à accéder directement à ces tissus. Ainsi, ces dernières années, à des fins de recherche à la clinique, les échantillons de LCR ont été obtenus de patients atteints de maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer et autres démences1,2,3. Il existe plusieurs tests de biomarqueurs qui ont été développés en utilisant des échantillons de LCR pour éventuellement aider dans le diagnostic des maladies à la clinique2,3. Cependant, il y a beaucoup de débats sur la fiabilité de ces tests pour produire des résultats constants et sensibles pour diagnostiquer précisément la maladie4,5. Donc, il y a un grand besoin pour le développement de la meilleure des dosages et des objectifs qui peuvent être trouvés dans le LCR, pour aider à produire une technique standard pour diagnostiquer les maladies neurodégénératives avec plus de sensibilité et de spécificité. En raison de l’importance potentielle des échantillons de LCR humaines dans la maladie, la collection du CSF de rongeurs dans la recherche en neurosciences est également intéressant.
Les souris sont des animaux importants dans la recherche biologique et médicale et permettant l’analyse de composés thérapeutiques potentiels et les études de validation avant d’essais cliniques humains. Cependant, chez les souris il est difficile d’obtenir des échantillons de LCR en raison de sa proximité au cerveau dans un petit animal, étant donné que la méthode habituelle de CSF collection chez la souris doit l’obtenir par l’intermédiaire de la cisterna magna, une ouverture entre le cervelet et la surface dorsale du bulbe rachidien. Cela provoque des difficultés dans la collecte d’échantillons de LCR car cette zone est difficile à décortiquer à et à proximité des vaisseaux sanguins, augmentant le risque de contamination par les globules. En raison de ces difficultés, la plupart des chercheurs ne peuvent obtenir une petite quantité de LCR pour analyse (habituellement soit le µL 5-7) et la contamination des échantillons de LCR par les globules est une préoccupation majeure pour les analyses6,7,8 , 9. contamination de sang peut obscurcir les résultats et ne reflète pas véritablement l’état de la CNS. En outre, limitée de l’échantillon recueillie peut avoir un impact recherche que la quantité habituelle provenant de souris suffit pour qu’une seule mesure (en double ou triple exemplaire) à l’aide de dosage immuno-enzymatique (ELISA). Ainsi, échantillons de LCR sont habituellement mis en commun de plusieurs souris afin d’avoir suffisamment d’échantillon pour exécuter plusieurs tests. Élaboration d’un protocole pour les abondants, collection non contaminée du FSC provenant de souris est vivement souhaitée et sera bénéfique dans l’amélioration de la recherche en neurosciences à l’aide de rongeurs.
Dans ce protocole, une technique pour les abondantes (en moyenne 10-15 µL) collection de peste porcine classique chez des souris anesthésiés est décrit en détail et améliore sur une méthode actuellement connue de collection de CSF pour minimiser la contamination du sang,10. Un protocole robuste pour collection CSF facilitera le développement de dosages de biomarqueurs axée sur le CSF, qui pourrait être utilisé pour aider à diagnostiquer la maladie, en plus d’améliorer la recherche sur les mécanismes qui sous-tendent les maladies affectant le système nerveux central.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit en détail une technique qui améliore le cours méthodes10 collection CSF pour minimiser la contamination du sang et permettre la collection abondante du CSF (en moyenne ~ 10-15 µL peuvent être obtenues) de souris. Lors de la rupture de la pointe capillaire, l’extrémité du capillaire ne doit pas être trop petite (comme à l’époque le CSF sera extrait de très lentement) ou trop gros (sera ne pas assez pour recueillir le CSF fine et tissus peuvent se loger dans le tu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (81650110527, 81371400) et la National clé base Research Programme of China (2013CB530900).
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
Riferimenti
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