Synthèse des fonctionnalisées 10 nm revêtement polymère des particules d’or pour le ciblage de l’endothélium et MEDICAMENTS

1. la préparation ou l’acquisition de Solutions mères (doivent être conservés à température ambiante ou au congélateur jusqu’à utilisation) Préparer une solution 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) en dissolvant 400 mg NaOH dans 10 mL d’eau ultrapure à température ambiante et bien mélanger les matières.NOTE : L’eau Ultrapure est définie comme l’eau sans impuretés telles que particules, bactéries, nucléases, des ions ou des traces de matières organiques. Un système de purification est utilisé pour obtenir l’eau ultrapure, entraînant sa résistivité de jusqu’à 18,2 mΩ·cm, ce qui indique une faible contamination anionique. L’utilisation de l’eau ultrapure embouteillée commercialement disponible n’est pas recommandée. Désormais, cette eau ultrapure désignera pour que l’eau, sauf indication contraire. Préparer une solution NaOH 6M en dissolvant 2,4 g de NaOH dans 10 mL d’eau et conserver la solution à température ambiante. Préparer une solution d’acide chloraurique (HAuCl4) 250 mM en dissolvant 1 g secs HAuCl4 à 10,16 mL d’eau. Diluer 1 mL de 250 mM HAuCl4 avec 9 mL d’eau pour obtenir la concentration de travail de 25 mM HAuCl4. Stocker la solution de4 HAuCl à la température ambiante. Préparer un tampon de carbonate de 0,1 M à pH 8,8, dissoudre le bicarbonate de sodium de 84 mg dans 10 mL d’eau et en ajustant le pH à 8,8 par ajout de 6 M de NaOH à l’étape 1.2. Stocker le tampon de carbonate à température ambiante. Mélangez 20 mL de tétrazolium composé, 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium sel (MTS), avec un agent stabilisant, phénazine ethosulfate (PES) (voir la Table des matières). Conserver le mélange MTS/PES dans parties aliquotes (pour un maximum de 10 cycles de gel-dégel) à-20 ° C dans l’obscurité. 2. synthèse des nanoparticules or coeurs Préparer une solution diluée de THPC en ajoutant 12 µL de 80 % THPC dans l’eau à 1 mL d’eau dans un tube à microcentrifugation à température ambiante. Fixer un ballon à fond rond de 100 mL au centre d’une plaque d’agitation magnétique. Versez 45 mL d’eau dans la fiole et agiter l’eau à 300 tr/min en utilisant une barre de petite agitation magnétique en forme de œuf. Ajouter 0,5 mL de 1 NaOH M et 1 mL de solution diluée de THPC. Continuez à remuer le mélange réactionnel vigoureusement pendant 5 min. Continuez à remuer le mélange et ajouter 2 mL de 25 mM HAuCl4 solution. La couleur du mélange passe du jaune au brun foncé dans les secondes, indiquant que la formation de THPC plafonné AuNPs avec une charge négative. Agiter le mélange pendant une 15 minutes supplémentaires permettre la formation complète des noyaux or. 3. Ajout de la Couronne de polymère autour des nanoparticules d’or Pendant la période de 15 min indiquée au point 2.3, préparer la cheville solutions par dissolution de chacun des éléments suivants dans 1 mL d’eau dans des flacons en verre 4 mL : 30 mg NH2-PEG-SH ; 7,5 mg m-PEG-SH ; 7,5 mg COOH-PEG-SH.Remarque : Les concentrations résultantes doivent être 8,8 M NH2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH et 3,75 M COOH-PEG-SH. Après avoir réduit la vitesse d’agitation de la solution dans le ballon à 100 tr/min, ajouter que les solutions de PEG à la solution de THPC plafonné AuNPs goutte à goutte. Continuez à remuer le mélange doucement pendant la nuit, à température ambiante, afin d’assurer une élimination efficace des THPC et le remplacement par PEG. Pour le prochaine 72 h, utiliser une membrane de cellulose coupure de 12-14 kDa poids moléculaire pour dialyser le mélange agité contre un seau de 4 L d’eau agité à 60 t/mn. Nouer les extrémités des membranes par des clips de dialyse et transvaser la solution par l’intermédiaire de pipette.Remarque : Ce processus de dialyse avec la membrane coupure de 12-14 kDa ne supprime que PEG n’ayant pas réagie, THPC et autres réactifs chimiques, par la diffusion le long d’un gradient de concentration. Pour maintenir le gradient de concentration élevé et promouvoir la diffusion continue, changez l’eau toutes les 2 h pour les 6 premières heures et toutes les 6 à 12 h pour le restant de 66 h.Remarque : L’objectif de la présente annexe de changement de l’eau est d’accueillir la diffusion rapide qui se produit dès le départ, en raison de la concentration initialement élevée au sein de l’échantillon. Le processus de dialyse susmentionnés feuilles de la solution de nanoparticules semi-purifiée, parce que les nanoparticules, précipités, les agrégats et autres impuretés de grande taille ne peut pas passer à travers les pores de la membrane coupure de 12-14 kDa. Filtrer la solution de nanoparticules semi-purifiée dans un tube conique de 50mL à l’aide d’un filtre de seringue 0,2 µm pour éliminer les précipités restantes, les agrégats et autres impuretés de grande taille. Placer le tube à fond conique dans un congélateur à-80 ° C et laisser la solution purifiée de PEGylated AuNP (PEG-AuNP) de geler pendant environ 5 h. Utiliser un sécheur de gel à lyophiliser le PEG-AuNP purifiée. Conserver le PEG-AuNP sec et purifié à 4 ° C jusqu’à l’utilisation. 4. conjugaison des Fluorophores à l’aide de N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester sur les NH2 groupes sur le PEG-AuNP Fixer un ballon à fond rond 50 mL sur le centre d’une plaque d’agitation magnétique. Remplir le flacon 18 ml d’eau et agiter l’eau à 100 tr/min à l’aide d’une barre d’agitation magnétique en forme de œuf. Peser 2 mg de la PEG-AuNP lyophilisée dans un tube conique de 4 mL, à l’aide d’une échelle de benchtop de haute précision. Utilisez un pistolet antistatique pour éliminer la charge statique et s’accrochant de la poudre de PEG-AuNP à la surface du tube. Ajouter 2 mL d’eau dans le tube. Versez les 2 mL PEG-AuNP solution dans le ballon pour davantage de reconstitution dans un total de 20 mL d’eau. Continuez à remuer le mélange à 100 tr/min à l’aide d’une barre d’agitation magnétique en forme de œuf. Ajouter 1 mL de 0,1 M, pH 8,8 carbonate de tampon à la 20 mL de reconstitué AuNP contenue dans le ballon. Continuer à remuer. Ajouter 5 µL de l’ester de NHS fluorescent 10 mg/mL dans le diméthylsulfoxyde.Remarque : N’importe quel colorant fluorescent peut être utilisé dans ce processus. Remuer la cheville fluorescente du jour au lendemain. Gardez-le à température ambiante et recouverts de papier. Pour le prochaine 72 h, enlever des fluorophores excès en utilisant le protocole décrit à l’étape 3.3. En bref, dialyser le mélange brassé à l’aide d’un seau de 4 L d’eau et d’une membrane de cellulose coupure de 12-14 kDa poids moléculaire. Changez l’eau toutes les 2 h pour les 6 premiers h et toutes les 6 à 12 h pour le restant de 66 h. Obtenir 1 mL de la solution purifiée de PEG-AuNP fluorescente, à utiliser pour la caractérisation décrite ci-dessous dans la section 5. Gel et lyophiliser le reste de la solution afin d’obtenir des nanoparticules fluorescentes sous forme de poudre pour le stockage à 4 ° C, comme indiqué aux paragraphes 3.5 à 3.7. Utilisez un filtre de seringue 0,2 µm pour stériliser et enlever tout précipités potentielles une fois reconstituées pour applications de culture de cellules. 5. caractérisation des nanoparticules fluorescentes pégylé or Pour visualiser le noyau de la NANOPARTICULE or et quantifier les tailles à l’aide de microscopie électronique à transmission (TEM) Déposer 10 µL de la solution purifiée de PEG-AuNP fluorescente vers une grille de TEM de maille de carbone enduit. Après 5 min, utilisez un morceau de papier filtre à mèche soigneusement le liquide en excès loin du bord de la grille TEM jusqu’à un film contenant les fluorescentes que PEG-AuNPs est laissé pour compte. Découvre le PEG-AuNPs fluorescent à 80 kV et à un grossissement de 50 000-150 000. Prendre des photos numériques.Remarque : Uniquement le noyau or sera visible parce que la cheville n’est pas dense sur le TEM aux électrons. À l’aide d’un logiciel de mesure, de définir l’échelle de mesure en corrélation avec la barre d’échelle. Calculer le diamètre d’environ 20 cœurs or et ensuite déterminer le diamètre de noyau or moyen.Remarque : Le système d’imagerie TEM place automatiquement une échelle graphique sur les photos numériques. Mesure de la taille de nanoparticules hydrodynamique à l’aide de diffusion dynamique de la lumière (DLS) Transférer 1 mg de lyophilisé THPC-enduit AuNPs dans un tube de microcentrifuge à l’aide de l’approche décrite à l’étape 4.2. Le transfert de 1 mg de PEG-AuNP lyophilisé dans une éprouvette. Ajouter 1 mL d’eau dans chaque tube et transférer chaque solution AuNP à un 1 mL en plastique transparent. Placez une cuvette dans un instrument DLS et mesurer les diamètres hydrodynamiques sphériques en utilisant le logiciel d’analyseur de particules qui est intégré dans le système de listes de distribution. Tracer les diamètres hydrodynamiques mesurés à l’aide d’un format d’histogramme.Remarque : L’histogramme regroupera les nanoparticules de taille. Le plus grand groupe de nanoparticules permettra de clarifier le diamètre qui correspond le mieux à la taille de la AuNPs synthétisés dans le présent protocole. Confirmation de fluorescence fluorimétriqueRemarque : Le même échantillon et la cuvette de l’étape 5.2 peuvent servir à mesurer le signal fluorescent. Retirez la cuve de la DLS et insérez un spectrofluorimètre. Ensemble des signaux de la longueur d’onde d’excitation à 633 nm et lire la fluorescence émise le long d’une plage de longueur d’onde de 650 à 800 nm. Confirmer que le pic est environ 665 nm, qui correspond au pic d’émission pour le NHS.Remarque : Ajuster les longueurs d’onde d’excitation et d’émission selon le fluorophore utilisés dans le processus. 11 afin d’évaluer la biocompatibilité de dosage de MTS Dans un fond transparent 96 puits stériles vitroplants traités sur plaque, pipette 100 µL de milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM ; additionné de 10 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline/streptomycine) et 3,2 x 103 cellules dans chaque puits.Remarque : Dans cette étude, les cellules endothéliales de rat coussinets adipeux sont utilisés. Un total de 21 puits sont utilisés pour permettre 3 répétitions pour chacune des 7 concentrations différentes de nanoparticules (Voir l’étape 5.4.3 pour des concentrations spécifiques d’intérêt). Laissez les cellules à confluence en humidité et 5 % CO2 contrôlée incubateur à 37 ° C11. Préparer les tubes de microcentrifuge individuels, chacun contenant 300 µL de DMEM avec des nanoparticules de diverses concentrations. Cette étude nécessite 7 différents tubes de DMEM avec les concentrations suivantes de PEG-AuNP : 0 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL et 1 000 µg/mL. Aspirer le DMEM du tube. Remplir les puits en trois exemplaires avec 100 µL de milieu DMEM contenant du 0, 10, 50, 100, 250, 500 ou 1 000 µg/mL de AuNP. Laissez les cellules et les nanoparticules co incubés pendant une durée prédéterminée, ici pendant 16 h. Vers la fin de la période d’incubation, décongeler le mélange MTS/PES de l’étape 1.5. Après incubation, aspirer le DMEM et les nanoparticules suspendus, lâchement attachés par les puits. Ajouter 100 µL de DMEM fraîche avec 20 µL de solution MTS/PES pour obtenir 1:5 MTS/PES ratio DMEM selon le protocole du fabricant. Incuber les cellules avec MTS/PES à 37 ° C pendant 2 h.Remarque : Ce temps d’incubation de 2 h est déterminé par l’activité métabolique des cellules endothéliales et peut être augmenté jusqu’à 4 h pour les autres types de cellules. Dans le délai de 2 h, le système commercial multilatéral est métabolisé par les cellules endothéliales en formazan colorée qui mêle le DMEM. Biocompatibilité des PEG-AuNP et la probabilité de la viabilité cellulaire seront en démonstration avec formazan plus coloré. Toxicité du PEG-AuNP et la possibilité que les cellules meurent s’affichera avec des couleurs moins intenses. Effectuer une analyse colorimétrique de chaque puits par lecture d’absorbance à 492 nm avec un lecteur compatible. Pour chaque concentration de nanoparticules, calculer l’absorbance moyenne de valeurs d’absorbance en triple. Diviser l’absorption moyenne de la valeur obtenue par absorption dans les puits contenant des nanoparticules 0 µg/mL en moyenne.Remarque : Ces puits contenant aucune AuNPs servent de commandes pour calculer le pourcentage de viabilité cellulaire en réponse aux nanoparticules traitement administré dans les autres puits. Évaluation de microscopie confocal fluorescence de nanoparticules absorption dans les cellules endothéliales adhérentes avec glycocalyx intacts ou dysfonctionnel11 Semences 1,0 x 104 cellules/cm2 rat gras touche des cellules endothéliales sur couvre-objet en verre stérile 12 mm et nourrir les cellules avec DMEM additionné de 10 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline/streptomycine. Laissez les cellules à se développer à confluence pleine d’humidité et de CO2 contrôlée incubateurs à 37 ° C, pendant environ 3 jours. Ajouter des traitements pour modifier le glycocalyx, le cas échéant. Par exemple, 2 h de traitement des cellules endothéliales cultivées avec 2,5 x 10-6 IU héparinase enzyme III dégrade le glycocalyx par clivage spécifiquement sa composante de sulfate d’héparane.NOTE : Glycocalyx sain peut être modélisé par les cellules endothéliales de plus en plus comme indiqué au point 5.5.1 sans l’ajout d’enzymes de dégradation. Avec le glycocalyx endothélial laissés intacts ou rendu dysfonctionnel, incuber les cellules endothéliales avec AuNPs fluorescent à 550 µg/mL pendant 16 h ou autre moment désiré. Laver délicatement les cellules avec 2 mL de 37 ° C 1 % d’albumine sérique bovine dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; contenant 100 mg/L de calcium et de magnésium 100 mg/L). Plonger les cellules dans 2 mL de paraformaldéhyde à 2 % et 0,1 % de glutaraldéhyde dans du PBS et laisser les cellules à fixer pendant 30 min à température ambiante. Enlever la solution de fixation d’aldéhyde et laver les cellules avec température ambiante PBS pour trois cycles de 5 min. Avant l’application de l’anticorps primaire, exposer les cellules endothéliales au sérum de chèvre de 2 % dans du PBS pendant 30 min à température ambiante pour bloquer les sites de fixation non spécifique. Les cellules doivent être entièrement couverts par la solution de saturation. Incuber les cellules endothéliales du jour au lendemain avec 1 % anti-héparane sulfate primaire un anticorps dans le sérum de chèvre de 2 % dans du PBS à 4 ° C d’étiqueter la composante de sulfate d’héparane du glycocalyx. Assurez-vous que les cellules fixes sont entièrement en contact avec la solution d’anticorps. Le lendemain, lavez l’anticorps avec température ambiante PBS pour trois cycles de 10 min. Incuber les cellules endothéliales avec dilution de 1 : 1 000 de l’anticorps secondaire fluorescent approprié pendant 30 min à température ambiante, dans le sombre ou recouverte de papier d’aluminium. Lavez l’anticorps secondaire avec température ambiante PBS pour trois cycles de 10 min. Monter la lamelle sur lames de microscope utilisant un milieu anti-fondu montage contenant 4′, 6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI) pour la coloration des noyaux. Sceller les bords de la lamelle à l’aide de vernis à ongles. Image de la cellule endothéliale immunomarquage fluorescent échantillons avec la microscopie confocale, à l’aide de canaux bleus, vert et rouges sombre pour visualiser les noyaux, héparane sulfate glycocalyx et les nanoparticules, respectivement.