Expression transitoire de gènes étrangers dans des cellules d’insecte (sf9) pour l’analyse fonctionnelle de la protéine
Summary
Ce protocole décrit un système d’expression de protéine induite par le choc de chaleur (système de pile à pDHsp/V5-His/sf9), qui peut être utilisé pour exprimant des protéines étrangères ou évaluation de l’activité anti-apoptotique de protéines étrangères potentiels et leur tronqué amine acides dans les cellules d’insectes.
Abstract
Le système d’expression de gène transitoire est une des technologies plus importantes permettant d’effectuer l’analyse fonctionnelle de protéines dans le baculovirus in vitro système de culture cellulaire. Ce système a été développé pour des gènes étrangers expriment sous le contrôle du promoteur baculoviral dans les plasmides d’expression transitoire. En outre, ce système peut être appliqué à un test fonctionnel du baculovirus lui-même ou des protéines étrangères. Le système d’expression génétique transitoire plus largement et commercialement disponible est développé basé sur le promoteur du gène précoce immédiat (IE) de Orgyia pseudotsugata pourcentage nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Cependant, un niveau faible expression de gènes étrangers dans des cellules d’insectes a été observé. Par conséquent, un système d’expression de gène transitoire a été construit pour améliorer l’expression de la protéine. Dans ce système, les plasmides recombinants furent construits pour contenir la séquence cible sous le contrôle du Drosophila chaleur choc 70 (Dhsp70) promoteur. Ce protocole présente l’application de cette chaleur axée sur le choc pDHsp/V5-His (épitope V5 avec 6 histidine) /Spodoptera frugiperda cellule système (cellules sf9) ; ce système est disponible non seulement pour l’expression des gènes mais aussi pour évaluer l’activité anti-apoptotique des protéines de candidat dans des cellules d’insecte. En outre, ce système peut être soit transfecté avec un plasmide recombinant ou transfectées conjointement deux plasmides recombinants potentiellement fonctionnellement antagonistes dans des cellules d’insecte. Le protocole montre l’efficacité de ce système et fournit un cas pratique de cette technique.
Introduction
Deux systèmes d’expression de protéines ont été couramment utilisées pour produire des protéines : systèmes d’expression de protéine procaryote (système d’expression géniqueEscherichia coli ) et des systèmes d’expression protéine eucaryote. Un système d’expression de protéine eucaryote populaire est les baculovirus expression vector system (BEVS)1. Les baculovirus ont été utilisées comme agents de lutte biologique dans le monde entier d’agricoles et sylvicoles nuisibles. Dans les dernières décennies, les baculovirus ont été élaborés comme des outils biotechnologiques pour les vecteurs d’expression protéique ainsi. Le génome des baculovirus composé d’ADN à double brin circulaire et enveloppé de nucléocapsides2. À ce jour, plus de soixante dix-huit baculovirus isolats ont été séquencées3. Se fondant sur la cascade temporelle des baculoviral expressions de gènes dans des cellules d’insecte hôte, la transcription des gènes pouvait être classée dans quatre cascades temporelles, dont précoces immédiats, gènes retardé, début, fin et très fin4.
BEVSs ont été désignées pour que les promoteurs de gènes très fin (c.-à-d.polyèdre ou p10 promoteur) ont été utilisées pour conduire les gènes cibles, tandis que le baculovirus recombinant a été généré par recombinaison homologue. Expression des protéines étrangères dans des cellules d’insecte de baculovirus recombinant est similaire à celle des protéines de mammifères aux modifications post-traductionnelles (adaptées pour la production de glycoprotéines). Ainsi, le baculovirus a été largement utilisé5,6,7. Toutefois, l’une des limites sont la présence de différentes voies de la N-glycosylation dans des cellules d’insecte7.
Par conséquent, un nouveau système d’expression baculovirus, le système d’expression génétique transitoire, a été développé. Ce système exprime des gènes étrangers dans le lecteur de baculoviral promoteurs précoces immédiats (c’est à dire 1 promoteur) dans des cellules d’insecte. En utilisant ce système, la protéine-cible peut être exprimée immédiatement sous le contrôle du promoteur c’est à dire 1 tout en modifiant la voie N-glycosylation dans des cellules d’insecte, résultant en une meilleure oligosaccharides liés à N7. En outre, baculoviral gènes précoces immédiats sont transcrits par l’ARN polymérase II la cellule-hôte et ne nécessitent pas de n’importe quel facteur viral pour activation4. Par conséquent, protéines étrangères peuvent être exprimées dans des cellules d’insecte dans de brefs délais. À ce jour, le transitoire, système d’expression génique est une des technologies plus importantes permettant d’effectuer des tests fonctionnels de protéine dans le baculovirus in vitro système de culture cellulaire. Le système peut être appliqué pour analyser la fonction de baculovirus ou de protéines étrangères. Parmi les systèmes d’expression génétique transitoire disponibles dans le commerce repose sur les promoteurs de gènes précoces immédiats (IE) de Orgyia pseudotsugata pourcentage nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (promoteurs de OpIE2 et OpIE1).
Cependant, le plus faible niveau d’expression de gènes étrangers dans des cellules d’insecte était toujours un problème lorsque le système d’expression de gène transitoire axée sur le promoteur OpIE a été utilisé8,9,10. Ainsi, un autre système d’expression de gène transitoire a été construit selon le promoteur de la drosophile chaleur choc protéine 70 (hsp70) gène8,9. Le promoteur de hsp70 fonctionne plus efficacement que le promoteur baculoviral IE lorsque induite par choc thermique dans des cellules d’insecte10. Dans ce système, les gènes cibles ont été exprimés dans le lecteur de 70 (Dhsp70) promoteur de Drosophila chaleur choc. Des gènes étrangers peuvent être facilement clonés dans le plasmide d’expression génétique transitoire par clonage des méthodes basées sur la PCR. En outre, le contrôle du moment pour l’expression des gènes peut être effectué par induction de choc thermique.
Dans ce rapport, nous suivons la démarche et exprimer trois troncatures différentes du gène baculoviral (inhibiteur de l’apoptose 3, iap3 de Lymantria xylina MNPV) en utilisant le système d’expression de protéine transitoire axée sur le choc thermique et d’appliquer ces protéines exprimées sur l’analyse de l’activité anti-apoptotique. Ce système peut exprimer soit rapidement de protéines étrangères ou être davantage appliqué à l’évaluation de l’activité de la protéine anti-apoptotique dans les cellules sf9, tout en ayant le potentiel pour être appliquée à d’autres tests d’activité protéine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le concept de système de pile à pDHsp/V5-His/sf9 axée sur le choc thermique a été décrite par Clem et al. , 1994,8. Comparaison du promoteur du gène baculoviral (IE1) et Drosophila hsp70 a montré que hsp70 avaient une plus grande efficacité en moustique cellules10. En outre, en raison de l’induction de choc thermique, le moment d’expression de la protéine pourrait être contrôlé précisément après le traitement de choc t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Jian-khoudja Leu d’Institut de Biologie Marine, National Taiwan Ocean University pour la fourniture de 3 constructions de plasmide. Cette recherche a été financée par Grant 106-2311-B-197-001 – du ministère de la Science et la technologie (MOST).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
Riferimenti
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