魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイ セクション

すべてのプロシージャ、手順など動物の被験者に関連、動物倫理委員会 (Regierungspräsidium カールスルーエ) によって承認されている、ハイデルベルク大学のアニマル ・ ケアのガイドラインに従ってください。 1. 固定液の作製 (4 %pfa/PBS) 組織学的組織の整合性の最適な保全を確保するため定着性の新鮮な毎日を準備します。 90 mL 二重蒸留水 (ddH2O) で常に室温で攪拌しながら水酸化ナトリウム (NaOH) の 0.2 g を溶かします。 4 g パラホルムアルデヒド (PFA) を追加し、ソリューションは高分子の重合を保証するために、少なくとも 5-10 分の完全に明確になるまで混ぜます。注意: PFA は毒性、取り扱い注意。 ソリューションのリン酸二水素ナトリウム (NaH2PO4) の 0.84 g を溶解し、測定経由で 7.2 に pH を制御します。 DdH2O と 100 mL にボリュームを調整し、グレード 3 フィルター ペーパーを通してソリューションをフィルター処理します。 ストア 4 %pfa/PBS 氷の上。 2. 安楽死溶液の調製 注: 次の手順は、6-8 月の一般的な年齢で ABTL ゼブラフィッシュ野生型株で行われました。 エチル 3-アミノ安息香酸メタン スルホン酸、また名前付き”tricaine”または MS-222、ゼブラフィッシュ安楽死160.31 mg/mL の濃度を使用します。安楽死ソリューション用の溶剤としてゼブラフィッシュ胚を高めるために使用される 1 の x 卵水を利用します。一般的に、平衡の損失を示すことによって鎮静魚で作業する前に正しい麻酔深度を制御し、反応損失をタップします。 卵水 x 10 の 1,000 mL を達成するために 1,000 mL 二重蒸留水 (ddH2O) へのこれらの塩を常に次の順序で攪拌しながら追加: 10 g、食塩 0.3 g、塩化カリウム 0.4 g CaCl2 *6 H2O、1.32 g MgSO4 *6 H2o. 3. ゼブラフィッシュ ティッシュの固定 6 ウェルの井戸にサンプルあたり 6 mL 4 %pfa/PBS 溶液を事前に転送します。 (前回の標準光日サイクルで、例えば、12 h: 12 h 維持されます) 大人のゼブラフィッシュを安楽死させる 2 h 後、tricaine ソリューションにそれらを置くことによって、朝に点灯し、安楽死に達するまで待ちます。次の弁蓋部の動きの停止、最大 10 分かかることができます。 Tricaine 安楽死ソリューション外の魚をとり、新鮮なペーパー タオルの上に置きます。魚を乾燥させ、蓋の後ろ頭をカットするメスを使用して (図 2 a参照)。作りたての定着剤が含まれて準備中のウェル プレートに直接ヘッドを転送します。 4 ° C で魚の頭を含むウェル プレート固定を確保するために、少なくとも 24 時間一晩ストア網膜深層に浸透します。注: 1 蛍光信号強度の関連する損失することがなく準備する前に 4 ° C、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 48 h の最大値のゼブラフィッシュ ヘッドを格納できます。待ち時間の増加は組織の完全性の損失につながることができます画像品質を削減し、ので避けてください。 4. ゼブラフィッシュ網膜血管系の準備 温水 2% の agarose のペトリ皿の三番目までを記入し、寒天がしっかりするまで待ちます。目を解剖するためのワークスペースを作成する 1x PBS で寒天プレートをカバーします。注: これにより、準備ピンセットや低圧の両方の保全組織、解剖しながら構造上の損傷の可能性を減らすこと。追加エピ照明と解剖顕微鏡の下で罰金のヒント #5 ストレート鉗子を利用したこのワークスペースですべてのそれ以上の準備の手順を行わなければなりません。 解離性、概要および組織の評価の詳細を指向できるように倍率 6.0 x 4.0 x との間を使用します。 シャーレに固定サンプルを転送し、カット面 1 つピンセットで頭を保持することで眼窩で眼球下別固定一緒にピンセットを挿入します。ゆっくりと眼の下ピンセットと、視神経をグリップし、慎重に涙開き目 (図 2 b) をデタッチします。 図 2: アダルト ゼブラフィッシュ眼の削除します。眼窩とそのまま視神経(A)でまだ目で角膜の側面図です。戸建目(B)で角膜の側面図です。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 4 つの直筋と目だけでなく、眼窩に目を接続する残留の眼組織に接続されている 2 つの斜めの外眼筋のいずれかを削除 (図 3および図 4を比較)。 半分閉じた状態のピンセットで目を押してこれを達成するため、他のピンセットの構造を掴んで、そっとそれをリッピングとは正反対の動きで。内部容器破損につながる直接眼球を握り、のでこの手法は血管系を維持するために適切に優しいです。 図 3: フォーカスの外眼筋と大人ゼブラフィッシュ目。外眼筋のフォーカス(A)眼のグローブの左の外側の縁に添付ファイル付きの側面図。視神経(B)を左右対称に並ぶ外眼筋と視神経の側面図です。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 27 G (0.4 × 19 mm) の使い捨て針を使用して、外側の範囲で角膜 (図 4、赤い矢印) を穿刺します。この開口部を通して角膜を持つ両方のピンセットと少しそれを開いて涙します。その後慎重に中央揃えを作成する作業は、それぞれの瞳孔のサイズ約を引き裂きます。 図 4: すべての外眼筋の除去後大人ゼブラフィッシュ眼。眼のクリアの外側の縁と外側のビューは、表示されている(A)グローブします。途中で視神経と視神経の側面図です。光反射強膜は神経 (赤い破線) まわりの全区域をカバーしていない(B)。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 虹彩の上外側の角膜縁で眼の世界 (球輪) の角膜側の圧力を適用されます。これは小さな凹みを作成し、角膜の涙の高さにレンズをプッシュします。レンズの下でピンセットを実行し、(図 5 a) を削除します。 図 5: レンズの取り外しの過程において大人ゼブラフィッシュ目。レンズと角膜のサイドビューは、角膜の涙(A)を介してプッシュ。(B)眼のグローブの横にあるレンズで角膜の側面図です。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 研究者が直面している視神経逆さまに目を向けます。強膜、角膜が接続されているし、カップ状網膜を保護するために目の電球の繊維状のチュニックの形に注意してください。(図 6)。 このシェルは、角膜と強膜、成ると視神経 (図 4 b、赤い破線) 周辺を”corneosclera”とスペアが呼び出されます。この中止は、強膜と網膜の間の開口部を作ります一度に針を挿入します。 図 6: 強膜、角膜は、残りの眼内組織から切断で構成される Corneosclera です。角膜側表示半透明の角膜の色素性強膜(A)への継続。側面図は、corneosclera (B)の強膜の一部に焦点を当てた。削除された corneosclera (C)の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 このアクセスを使用すると、両方のピンセットで、慎重に強膜軸にリッピング視神経乳頭周囲の開口部を大きくストライプ。角膜側周囲への移行で、corneosclera をそのまま維持する注意してください (図 6A参照)。 1 つピンセットと、他の視神経を掴んで強膜を保持と引き離し、完全目から、corneosclera を削除し、破棄 (図 6)。他の構造への愛着は重要なポイントになりますので、corneosclera、残りの眼内組織を分離する前にすべての接続を断絶しようこの手順はブドウ膜と網膜血管 (図 7) を含む網膜から成るカップ状の構造を提供します。 残りのカップに 27 G の針横を押し針の先端の縁と外側の表面を削りながら脈絡膜・網膜色素上皮層の破裂を作成します。アクセス ポイントとして脈絡膜・網膜色素上皮層のグリップを得るストライプに、両方のピンセットでそれをリッピング、アイリスへの接続をそのままに破壊を使用します。 その後、虹彩下 1 つピンセットを実行し、複合構造の剥離を達成するために廃止された脈絡膜・網膜色素上皮層で引いてテンションを作成しながら外から回路に回る。注: アイリス外す必要があります、(図 8 b) 血管を可視化しながら蛍光を妨げないように。虹彩が周囲の組織にまだ接続されているので、広範な容器損傷、特に内側の光円 (IOC) につながることができます直接それを削除アイリスをつかみます。脈絡膜層と網膜色素上皮 (RPE) 分けることができるし、アイリス、セカンダリ取り出しやすくするためことができますへの接続を保つことがよく。 アイリスの部分は削除できません、虹彩を削除する手順、4.9 に同様の方法で大人ゼブラフィッシュ眼の視細胞層 (PL)、内部展示自然な限界点を利用します。 破断点 (図 11、黒い矢印) 上記 PL の廃止を誘導するために残りのカップ形網膜の外側を擦りなさい。虹彩への可能な接続をそのままに保ちながら層の上の部分を削除するのにには、作成したアクセスを使用します。その後、虹彩下ピンセットを実行し、複合構造をデタッチする前に述べたように、回路の周りに行きます。: 1 つべきである注意忍耐 4.9 の全体の手順は難しい、することができますが、このケアは素直瞳孔縁の虹彩をつかんでや脈絡膜/RPE への接続を破壊することによって強制的に開口部よりもより良い血管結果を達成するか視細胞層、それぞれ除去なし。この手順を次従って網膜血管整合性を維持が外側の網膜の層の損傷に導きます。 図 7: corneosclera の除去後大人ゼブラフィッシュ眼。側面ビューには、そのままアイリスと視神経(A)と残りの眼内組織が表示されます。フォーカス(B)での虹彩と角膜の側面図です。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 視神経、網膜にできるだけ近くをカットするのに直線 2.5 mm 刃付けレーザーマイクロダイ セクション春シザーを使用します。これは、組織の良いフラット マウント用となります。 図 8: 切り捨てられた視神経と網膜色素上皮・脈絡膜の除去後大人ゼブラフィッシュ目。視神経のサイドビューは、 (A)の切り捨てられた視神経と網膜を示しています。(B)網膜の最も内側の層の上に直接見てと角膜の側面図です。(C)このステップでゼブラフィッシュ眼の模式図。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。 5. 網膜血管系の実装 1x PBS で 5 分間 2 回切り裂かれた網膜を洗います。網膜を視神経の切り捨て後、転送するには、露出した組織の直接処理を避けるためにマイクロ スプーンの端ラボへらを利用します。 スライド ガラスに PBS のドロップを配置し、液滴に網膜を転送します。場所で網膜のサイズに応じて 4 枚の花びらや 5 花びらフラット形状を作成するメスのカップ状の構造を削減しながら、組織を維持するピンセットを使用して (図 9を参照)。 紙の細かい部分で残った PBS を吸います。網膜に触れないように注意してください。 メディアをマウントし、coverslip でカバー フラット マウント網膜をコートします。空気の泡は、網膜血管の可視化を歪めることができるフォームを作成しないように気配りします。 Coverslip の動きを最小限に抑え、クリアのマニキュアを使用してカバーのシールします。 6. 網膜血管の可視化 準備と可視化の蛍光信号の損失を介して画像詳細の損失を減らすために可能な限り短い間の時間ギャップを維持します。画質の劣化はゆっくりと準備の後表示 48 h になると直接可視化を達成することはできない場合に、信号の損失を減らすために 4 ° C で準備された網膜血管マウントを格納します。 蛍光顕微鏡による網膜血管系のマウントを視覚化またはレーザー走査型共焦点顕微鏡。注: 蛍光顕微鏡による血管の可視化は、2.0 s、6.0 の x とガンマの利得の露光時間で 2.5 倍の倍率で達成された 1.67 の設定。共焦点の顕微鏡検査のため、Ar レーザー (488 nm/20 mW) 20% の電力で組み合わせで x/0.7 20 TD 488/543/633 励起フィルターを利用した ddH2O 浸漬媒体および 505 560 nm の発光フィルター設定として NA 多液浸対物レンズ。共焦点画像は、網膜のサイズに応じてタイル スキャンを組み合わせる 4 x 4 や 4 x 5、5 × 5 の特異な画像で構成されます。 7 ゼブラフィッシュの網膜の彼セクション 注: ゼブラフィッシュの網膜の彼のセクションの組織に従って準備プロトコル手順 4.5 までとその後手順 7.1 に直接進みます。 1x PBS で 5 分間 2 回 (ステップ 4.5) あと除核に目を洗います。その後、70% エタノール (エタノール) に組織を転送します。この時点で準備ができて目はパラフィン包埋まで 4 ° C で保存できます。 組織のパラフィン包埋前に脱水する次の方法を洗う: 2 x 15 分 80% エタノール, 2 x 15 分 90% エタノール, 3 x 15 分 96% エタノール, 3 x 15 分 99% エタノール, 2 x 15 分 acetone/99% エタノール (1:2)、アセトンで 3 x 15 分で。パラフィンでの組織を 62 ° C で一晩保ちます。 新鮮なパラフィン 62 ° C に熱するし、金型を埋め込むことにそれを注ぐ。直接金型に、任意のセクションの速いペースで、目の向きが正しい制御組織を転送します。その後、追加加熱パラフィンでカバーして金型に埋め込みカセットを適用されます。 パラフィン ブロック冷却した後、埋め込み型を削除します。10 μ m のセクションにミクロトームでパラフィン ブロックをカットして、それらを完全に平らにするそれらのために十分な長さの水表面上 45 ° C の水浴に浮きます。 スライド ガラス上のセクションをキャッチし、垂直方向に 45 ° C のオーブンで一晩干す前に余分な水分を除去するために排水 Deparaffinize に次のスケジュールと HE 染色のセクションがさらにプロセス: キシロール、99% エタノール, 1 x 1 分 96% エタノール, 1 x 1 分 80% エタノール、70% エタノール、ddH2O、マイヤーのヘマトキシリンで 1 x 4 分の 1 × 1 分の 1 x 1 分で 1 x 1 分で 4 x 1 分、ddH2O、0.5% エオシン, 1 x 30 の 1x2min の 1 × 10 分 ddH2O, 1 x 30 s は 80% のエタノール、2 x 30 96% のエタノールで s、99% エタノールで 3 x 1 分 s、キシロール 1 x 1 分。 キシロールからスライド ガラスを取るし、すぐにメディアのマウントを持つ組織をカバーします。組織を完全に乾燥、上、coverslip の場所し、ステンド グラスの組織をシールのように避けてください。