Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Lucas Moritz Wiggenhauser; Katharina Kohl; Nadine Dietrich; Hans-Peter Hammes; Jens Kroll

doi:10.3791/56674

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Medicina

물고기는 눈을 통해 당뇨병을 공부: 기정, 시각화, 및 성인 tg(fli:EGFP) Zebrafish 망막 맥 관 구조 분석

Published: December 26, 2017

doi:

10.3791/56674

Lucas Moritz Wiggenhauser¹, Katharina Kohl², Nadine Dietrich², Hans-Peter Hammes², Jens Kroll¹

¹Department of Vascular Biology and Tumorangiogenesis, Center for Biomedicine and Medical Technology Mannheim (CBTM), Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University, ²V. Medical Clinic, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University

Summary

여기, 우리는 방법 프로토콜 neoangiogenesis 및 구조적인 변화에 연결 된 장기 혈관 병 리의 설정에서 빠른 읽기로 쉽게 성인 tg(fli:EGFP) zebrafish 망막 맥 관 구조 분석 수 있는 논의.

Abstract

당뇨병 성 망막 증은 중 년 성인 중 실명의 주요 원인. 전세계 당뇨병의 상승 퍼짐은 다음 수 십년의 주요 연구 분야 중 하나 하는 당뇨병 microvascular 합병증의 예방 할 것입니다. 전문, 타겟 치료와 새로운 치료 약물 시각 손실의 위험에 환자 들의 증가 관리 하기 위해 필요 합니다. Zebrafish는 대사 multifactorial 질병 프로세스 모델링에 대 한 관련성을 증가 함께 발달 연구 질문에 대 한 설립된 동물 모델 이다. 종족의 장점 최적의 시각화 및 심사 방법, 유전자의 관심 밖으로 노크 강력한 능력을 가진 결합 하는 높은 처리량 마약 허용. 여기, 우리가 neoangiogenesis 또는 선박 손상에 연결 된 장기 혈관 병 리의 설정에서 빠른 읽기로 쉽게 성인 tg(fli:EGFP) zebrafish 망막 맥 관 구조 분석 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 이것은 제 브라 망막의 해 부 및 조직의 전체 설치를 통해 달성 됩니다. 노출 된 혈관의 시각화 다음 성인 망막 맥 관 구조에 표현 하는 녹색 EGFP 기자의 confocal 현미경 검사 법을 통해 이루어집니다. 조직의 올바른 처리 이어질 것입니다 더 나은 결과 내부 용기 파손에 보다 적게 변경 되지 않은 혈관 구조의 시각화를 보장. Zebrafish 모델 망막 vasculopathy 선박 건축 뿐만 아니라 neoangiogenesis의 변화에 연결 된 메서드를 활용할 수 있습니다.

Introduction

당뇨병은 혈당 장애 인슐린 분 비 또는 인슐린 분 비 부족 조직 응답에서 결과 의해 정의 된 대사 질병 이다. WHO 견적 422 백만 성인 당뇨병 mellitus 2014¹ 에서 살고 있었다 그리고 전세계 당뇨병의 유 병 률은 당뇨병에서 주요 연구 분야 중 하나를 만들기까지 2035², 인구의 8-10% 증가할 것으로 예상 된 다음 십 년간입니다. 만성 고 혈당과 함께 생활 장기 microvascular 합병증, 당뇨병 성 망막 증, 신 장병, 그리고 증을 포함 하 여 이끌어 낸다. 이러한 합병증의 예방과 관리는 어려운; 실제로, 당뇨병에 이르게 투 석², 끝 단계 신장 질병 (ESRD)의 가장 빈번한 원인이 되고있다 그리고 당뇨병은 중 년 성인³중 실명의 주요 원인.

초기 당뇨병 눈에 microvascular 손상의 원인은 만성 고 혈당 증, 대사 변경, 뿐만 아니라 특정 위험 요소 (예를 들면, 고혈압, dyslipidemia), 혈관 내 피 기능 장애, pericyte 강하, 선도 및 모 세관 회귀 acellular 혈관 소매에 결과입니다. 결과 망막 허 혈 neovascularization 및 증가 혈관 침투성 증식 당뇨 성 망막 증 (PDR)⁴의 발전의 원인입니다. 당뇨병 성 망막 증 시력을 위협 하는 당뇨병 성 망막 증은 UKADS 연구⁵스크린된의 백색 유럽 일대의 12%에서 확인 하는 동안 당뇨병 환자의 37%에서 일반적으로 발견 되었다. 현재 치료 수만 추가 합병증을 예방 되며 이미 유도 피해를 완전히 복원할 수 없습니다. Glycemic 컨트롤, 뿐만 아니라 Panretinal photocoagulation 증식 당뇨 성 망막 증 (PDR)에 대 한 표준 치료 이지만 또한 인접 한 건강 한 조직에 영향을 줍니다. 안티-VEGF 개입 레이저 치료⁶^,⁷, 하지만 궁극적으로, 전문, 타겟 치료에 대 한 대 안으로 유망한 결과 표시 하 고 새로운 약물 시각 손실의 위험에 환자 들의 증가 관리 하는 데 필요한.

당뇨병 성 망막 증의 설립된 동물 연구 모델 팬 들은 인간의 이상의 모든 측면의 정보를 공유 하지 않습니다. 과학 연구 질문의 특정 요구 사항을 해결 하기 위해 올바른 종 활용 실험 설치의 가장 기본적인 부분 중 하나입니다. Zebrafish 태아 (Danio rerio) 발달 연구에서 이미 널리 사용 되 고 morpholinos 또는 CRISPR/Cas9 기법⁸을 통해 최저의 또는 녹아웃 특정 유전자를 최적의 실용적인 백그라운드를 제공 한다. 이러한 메서드는 쉽게 zebrafish 대규모 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS), 질병의 진행 및 민감성⁹의 특정 메커니즘에 대 한 통찰력을 생성 하 여 확인 된 유전자를 조사에 활용할 수 있습니다. 짧은 세대 시간, 자손, 쉽게 많은 양의 고 저렴 한 비용 처리 및 분석 결과 지원 성장 특히 모델링 신진 대사 질환에 대 한 좋은 잠재력을 주어진 zebrafish 모델의 관련성을 증가 했다. Zebrafish의 생물 학적 메커니즘의 보존 약리 치료 개발을 위한 기반으로 표시 되었습니다. 예를 들어 antidiabetic 약 metformin과 콜레스테롤을 낮추는 simvastatin 표시 되었습니다 “치료” 캠프/dexamethasone 유도 높은 PEPCK 표현과 높은 콜레스테롤 다이어트 유발 된 콜레스테롤 혈 증¹⁰ 모델 조건 ^, ¹¹ ^, ¹². 지배적인 보존된 대사 메커니즘에 전진이 통찰력은 실험을 통해 zebrafish 당뇨병 모델의 증가 의해와 같은 지원 추가: 포도 당 솔루션에서 인큐베이션을 번갈아 Streptozotocin 유도 절제, 베타 세포의 nitroreductase 중재 베타 세포 제거 prodrug metronidazole, monogenic 당뇨병 모델의 골격 근육에서 증가 인슐린 저항 뿐만 아니라 pdx1 유전자 최저 또는 녹아웃을 통해 중재를 사용 하 여 ¹².이 이미 프로토콜, 종, 위에서 언급 한 특성을 설정 하 고 효율적으로 모든 샘플의 많은 수에서 게놈을 조작 하는 능력 입증 메커니즘 연구 zebrafish의 장점 약리학 내정간섭에 대 한 화면을 복잡 한 질병 과정으로 능력을 운전.

기본 zebrafish 눈 해부학 (그림 1)에 대 한 일반적인 이해 zebrafish 망막 angiopathy에 대 한 모델로 사용 하려면 필요는 것입니다. Zebrafish 눈 있으며 6 개의 안구 근육, 4 곧바로 삽입 2 개의 비스듬한 근육 sclera¹³에서 세계의 외부에 있습니다. 각 막 렌즈를 덮고 있는 투명 한 조직 그리고 sclera 눈의 바깥쪽을 형성에 직접 계속 됩니다. 공 막 엔 불투명, 부분적으로 가벼운 반영 표면을 이며 강하게 착. 렌즈 자체는 인간 보다 더 공 모양입니다. 산소 제공 망막 맥 관 구조 내부 신경 절 세포 층에 밀접 하 게 연관 subretinal 네트워크를 형성 하지 않는 동안 망막 신경 세포의 3 핵 계층으로 구성 됩니다. 안 배, 반면, 공 막과 망막 사이 거짓말 하 고 망막 안료 상피 (RPE)와 관련. 이 모 세관 네트워크¹⁴망막 외부 부분에 산소를 공급 한다.

그림 1: 성인 zebrafish 눈의 도식 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

망막 맥 관 구조의 간단한 시각화 유전자 변형 tg(fli:EGFP) zebrafish 선¹⁵의 활용에 의해 얻을 수 있습니다. 녹색 형광 단백질을 통제 하는 맥 관 구조의 내 피 세포에서 fli promotor의 표현 나중 단계에서 현미경 스캐닝 레이저를 통해 시각화를 위한 기초 이다. 이것은 제 브라 망막의 해 부 및 조직의 전체 설치를 통해 달성 됩니다. 이 유전자 변형 모델 혈관 내 라벨 또는 전체-마운트 immunohistochemistry의 모든 응용 프로그램 없이 빠른 혈관 판독을 제공합니다. Zebrafish에 당뇨병 성 망막 증, 분석 단계 및 표준화 준비 루틴 모든 것에 의해 사용 되어야 한다.다음 준비 프로토콜은 다른 연구 그룹 성인 zebrafish 눈의 노출된 혈관에 혈관 변화를 쉽게 평가 하 고 zebrafish 망막에 대 한 최적화 된 해 부 루틴을 설정 하는 지침을 제공 하는 옵션을 제공 합니다.

Protocol

단계를 포함 하 여 모든 절차, 동물 윤리 위원회 (Regierungspräsidium 칼)에 의해 승인 되었습니다와 하이델베르크 대학교의 동물 보호 지침에 따라 동물 주제 관련. 1. 정착 액의 준비 (4 %PFA / PBS) 조직학 조직 무결성의 최적의 보존 되도록 통 신선한 매일 준비 합니다. 끊임없이 실 온에서 교 반 하면서 90 mL 두 배 증류수 (ddH2O)에 수산화 나트륨 (NaOH)의 0.2 g을 분해. 4 g paraformaldehyde (PFA)를 추가 하 고 솔루션은 고분자의 depolymerization를 보장 하기 위해서 적어도 5-10 분 동안 완전히 명확한 때까지 저 어.주의: PFA는 독성, 주의 처리. 솔루션에 인산 나트륨 디 (NaH2포4)의 0.84 g을 녹이 고 pH 측정을 통해 7.2에서 제어. DdH2O 100 mL을 볼륨을 조정 하 고 3 학년 필터 종이 통해 솔루션을 필터링. 저장 4 %PFA / PBS 얼음에. 2입니다. 안락사 솔루션의 준비 참고: 다음 단계는 6-8 월의 일반적인 나이에 ABTL 야생-타입 zebrafish 긴장 수행 되었다. 또한 명명 된 “tricaine” 또는 MS-222, zebrafish 안락사160.31 mg/mL의 농도에서 에틸 3 aminobenzoate 메탄 된을 사용 합니다. Zebrafish 태아, 안락사 솔루션에 대 한 용 매로 인상 하는 데 사용 하는 1 x 달걀 물을 활용 합니다. 일반적으로, 균형의 손실을 시연 함으로써 진정 물고기와 함께 작업 하기 전에 정확한 마 취 깊이 제어 하 고 터치 반응 손실. 계란 물 x 10의 1000 mL를 달성,이 소금에 추가 1000 mL 두 배 증류수 (ddH2O) 다음 순서에 따라 지속적으로 교 반 하면서: 10 g NaCl, 0.3 g, KCl 0.4 g CaCl2 *6 H2O, 1.32 g MgSO4 *6 H2o. 3입니다. 고정 Zebrafish 조직 6 잘 플레이트의 우물에 샘플 당 6 mL 4 %PFA / PBS 솔루션을 사전에 전송 합니다. (이전에 표준 빛 날 주기, 예를 들어, 12 h 12 h: 유지) 성인 zebrafish를 안락사 2 시간 후 tricaine 솔루션에 그들을 배치 하 여 아침에 켜고 조명과 안락사에 도달 될 때까지 기다립니다. Opercular 운동의 중단, 다음을 최대 10 분까지 걸릴 수 있습니다. Tricaine 안락사 솔루션에서 생선 하 고 신선한 종이 타 올에 올려. 건조 한 물고기를 사용 하 여 메스는 operculum 뒤에 머리를 잘라 ( 그림 2A참조). 갓된 정착 액을 포함 하는 준비 잘 플레이트에 직접 머리를 전송 합니다. 스토어 잘 플레이트 4 ° C에서 물고기 머리를 포함 하는 정착 액을 보장 하기 위해 적어도 24 h에 대 한 하룻밤 더 깊은 망막 층을 관통 한다.참고: 제 브라 헤드 형광 신호 강도 관련 손실 없이 준비 하기 전에 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x는 1에서 48 h의 최대 저장할 수 있습니다. 대기 시간이 길어지면된 조직의 무결성의 손실로 이어질 수 있습니다 그림 품질을 감소 하 고 따라서 피해 야 한다. 4입니다. 제 브라 망막 맥 관 구조 준비 페 트리 접시 최대 3 온수 2 %agarose와 한 회사 될 때까지 기다립니다. 눈 해 부에 작업 영역을 만드는 1 x PBS와 천 배지 커버.참고: 이렇게 하면 준비 족집게와 낮은 압력의 두 보존 조직에 해 부를 하는 동안 구조적 손상의 가능성을 줄이고 있습니다. 모든 추가 준비 단계 추가 피-조명 해 현미경 미세 팁 #5 스트레이트 집게를 이용 하 여이 작업 영역에서 수행 되어야 합니다. 해 부, 하는 동안 4.0 x 6.0 x 사이 확대 사용 하 여 개요 및 세부 지향 평가 조직에 대 한 허용. 페 트리 접시에 고정된 샘플을 전송 하 고, 안구 아래 다른 고정-함께 트위터 궤도 구멍 삽입 한 트위터와 함께 잘라 표면에 머리를 눌러. 천천히 눈 아래 트위터와 그립 시 신경 다음 신중 하 게 찢 어 열고 눈 (그림 2B)를 분리 합니다. 그림 2: 성인 zebrafish 눈의 제거. 각 막 쪽 궤도 구멍에 그대로 시 신경 (A)여전히 눈으로 보기 분리 된 눈 (B)각 막 쪽 보기. 이 단계 (C)에서 zebrafish 눈의 도식 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 4 곧바로 궤도 구멍에 눈을 연결 하는 잔여 extraocular 조직 뿐 아니라 눈에 여전히 연결 된 2 개의 비스듬한 안구 근육의 제거 ( 그림 3 및 그림 4비교). 반 폐쇄 트위터를 통해 눈을 다시 개최 하 여 이것을 달성 하 고, 창과 다른 트위터와 구조, 부드럽게 그것을 벗어 버리고 지름 운동. 이후 내부 용기 파손에 이르게 직접 안구 댔 지,이 기술은 적절 하 게는 맥 관 구조를 유지 하기 위해 부드러운 이다. 그림 3: 성인 zebrafish 눈 초점에서 안구 근육. 초점 (A)눈 세계의 왼쪽된 바깥쪽 테두리에는 안구 근육의 부착을 가진 측면 보기 안구 근육 대칭으로 시 신경 (B)측면에 서는 시 신경 측면 보기. 이 단계 (C)에서 zebrafish 눈의 도식 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 외부 범위에서 각 막 (그림 4C, 빨간색 화살표)을 펑크 27g (0.4 x 19 m m) 일회용 바늘을 사용 합니다. 이 오프닝을 통해 각 막 두 핀셋으로 누른 약간 열고 눈물. 이후에 약 각 눈동자의 크기 가운데 눈물을 만들려고 신중 하 게 작동 합니다. 그림 4: 모든 안구 근육의 제거 후 성인 zebrafish 눈. 안구의 허가 바깥쪽 테두리와 측면 보기 글로브 표시 (A).중간에 시 신경으로 시 신경 측면 보기. 빛 반사 sclera 전체 주변 신경 (빨간색 파선)을 취재 하지는 (B). 이 단계 (C)에서 zebrafish 눈의 도식 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 홍 채 위에 외부 각 막 가장자리에 눈 글로브 (bulbus 륜)의 각 막에 압력을 적용. 이 작은 덴트 만들고 각 막 눈물의 높이를 렌즈를 밀어 것입니다. 렌즈 아래 핀셋을 실행 하 고 제거 합니다 (그림 5A). 그림 5: 렌즈 제거 과정에서 성인 zebrafish 눈. 렌즈와 각 막 쪽 보기 각 막 눈물 (A)를통해 밀 었 다. 눈 지구 (B)옆에 렌즈와 각 막 쪽 보기. 이 단계 (C)에서 zebrafish 눈의 도식 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 거꾸로 연구원을 직면 하는 시 신경에 눈을 설정 합니다. 참고 sclera 그리고 각 막 연결 되어 있고 컵 모양의 망막을 보호 하기 위해 눈 전구의 섬유질 튜 닉을 형성 합니다. (그림 6)입니다. 각 막과 공 막의 구성 된이 셸 라고도 “corneosclera” 및 예비 부품 (그림 4B, 빨간색 파선) 시 신경 주변 영역을 합니다. 하는 공 막과 망막 사이 여 만듭니다이 중단을 한 번에 바늘을 삽입 합니다. 그림 6: sclera 그리고 각 막, 나머지 안 구내 조직에서 분리 되는의 구성 된 Corneosclera. 각 막 쪽 보기 안료 sclera (A)으로 반투명 각 막의 연속을 보여주는. 측면 보기 corneosclera (B)의 scleral 부분에 집중 했다. 제거 corneosclera (C)의 도식 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 두 핀셋으로이 접근을 사용 하 여 신중 하 게 찢 어는 sclera 축방향 증가 시 신경 주위 여 줄무늬에. 각 막 쪽 둘레에 전환에는 corneosclera을 그대로 유지 조심 ( 그림 6A참조). 한 트위터와, 시 신경 다른 잡아서 sclera 누른 멀리 당기는, 전적으로 눈에서는 corneosclera를 제거 하 고 (그림 6)을 무시 합니다. 다른 구조에 첨부 될 중요 지점;는 corneosclera와 나머지 안 구내 조직 분리 하기 전에 모든 연결을 끊다 하려고 이 단계는 uvea 망막 맥 관 구조 (그림 7)를 포함 하는 망막의 구성 된 컵 모양의 구조를 제공할 것입니다. 안/RPE 레이어 바늘 팁의 가장자리와 바깥쪽 표면 근 근이 살아가고 있는 동안 27 G 니 들 옆으로 남은 컵을 개최 하 여 파열을 만듭니다. 액세스 지점으로 파열을 사용 하 여 안/RPE 계층에 대 한 입씨름 하 고 줄무늬로 두 핀셋으로 찢 어 하지만 아이리스에 연결을 그대로 유지. 나중에, 홍 채에서 한 트위터를 실행 하 고 주위에 서는 회로에 외부에서의 결합된 구조 분리를 달성 하기 위해 단종된 안/RPE 계층에서 당겨 긴장을 만드는 동안.참고: 아이리스 해야 끊을 수, 선박 (그림 8B)를 시각화 하는 동안 형광 방해 하지 있도록. 그것을 제거 하는 직접 홍 채를 잡는 홍 채 여전히 주변 조직에 연결 되어 있기 때문 내부 광학 원 (IOC)에 특히 광범위 한 혈관 손상 발생할 수 있습니다. 안 층과 망막 안료 상피 (RPE) 분리 될 수 있다 고 종종 쉽게 보조 제거할 수 있는 홍 채에 대 한 연결을 유지. 홍 채의 일부를 제거할 수 없습니다, 경우 4.9, 아이리스를 제거 하려면 단계를 비슷한 방식에서 성인 zebrafish 눈 포토 리셉터 레이어 (PL), 내부 전시 자연 한계점을 활용 합니다. 한계점 (그림 11C, 검은색 화살표) 위에 pl 광고나 유도 나머지 컵 모양의 망막의 외부에 다쳤어요. 만든된 액세스를 사용 하 여 홍 채에 가능한 연결을 그대로 유지 하면서 레이어의 위쪽 부분을 제거 하. 이후에, 홍 채에서 핀셋을 실행 하 고 결합 된 구조를 분리 하기 전에 언급 했 듯이 회로 주위에 서.참고: 하나의 운동을 해야 인 내 전체 단계 4.9 어려울 수 있습니다, 하지만이 케어 straightforwardly 눈동자의 가장자리에 아이리스를 잡아 또는 개방 안/RPE에 대 한 연결을 파괴 하 여 강제로 보다 더 나은 혈관 결과 달성할 것 이다 또는 그들의 각각 제거 없이 포토 리셉터 레이어. 이 단계를 따르는 것입니다 따라서 망막 혈관 무결성을 보존 하지만 외부 망막 층의 손상으로 이어질. 그림 7: 성인 zebrafish는 corneosclera의 제거 후 눈. 측면 보기 그대로 아이리스와 시 신경 (A)와 나머지 안구 내부 조직을 표시합니다. 초점 (B)에 홍 채와 각 막 쪽 보기. 이 단계 (C)에서 zebrafish 눈의 도식 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 직선 2.5 m m 절단 가장자리와 서 봄이 위를 사용 하 여 시 신경 망막;에 최대한 가까이 잘라 이것은 조직의 더 나은 평면 마운트 허용. 그림 8: RPE/맥락 막 그리고 잘린된 시 신경의 제거 후 성인 zebrafish 눈. 시 신경 측면 보기 잘린된 시 신경 (A)와 망막을 표시합니다. (B)망막의 가장 안쪽 계층에 직접 얼굴로 막 측면 보기. 이 단계 (C)에서 zebrafish 눈의 도식 묘사.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 5. 망막 맥 관 구조의 장착 1 x PBS에 5 분에 대 한 두 번 해 부 망막을 씻어. 망막 시 신경의 잘림 후를 전송 하려면 노출 된 조직에의 직접 처리를 피하기 위해 마이크로 스푼 끝으로 랩 주걱을 사용 합니다. PBS의 유리 슬라이드에 한 방울 놓고는 작은 물방울으로 망막을 전송 합니다. 망막 크기에 따라 4-꽃잎 또는 5 꽃잎 모양을 만드는 메스와 컵 모양의 구조를 절단 하는 동안 자리에는 조직 유지 하는 트위터를 사용 하 여 ( 그림 9참조). 종이의 정밀한 조각으로 남은 PBS 빨 아. 망막을 건드리지 않도록 주의 해야 합니다. 설치 미디어에는 coverslip 커버 평면 탑재 망막 코트. 공기 방울은 망막 혈관의 시각화를 왜곡할 수 있다 거품을 만드는 것이 아니라 세심 한 수 있습니다. coverslip의 움직임을 최소화 하 고 투명 매니큐어와 커버 인감. 6입니다. 망막 맥 관 구조 시각화 준비 및 형광 신호 손실을 통해 이미지 세부 손실을 줄이기 위해 가능한 시각화 사이의 시간 간격을 유지 합니다. 저장 이미지 품질의 저하는 천천히 준비 후 보이는 48 h 되이 직접 시각화를 얻을 수 없습니다, 경우 신호 손실을 줄이기 위해 4 ° C에서 준비 된 망막 맥 관 구조 마운트. 형광 현미경 검사 법을 통해 망막 맥 관 구조 마운트 시각화 또는 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법.참고: 형광 현미경 검사 법에 의해 선박 시각화 2.0 s, 6.0 x 및 감마의 이득에의 노출 시간 2.5 배 확대에서 달성 되었다 1.67의 설정. Confocal 현미경 검사 법, 대 한 한 아칸소-레이저 (488 nm/20 mW) 20% 전력에서 TD 488/543/633 여기 필터, 20 x / 0.7 조합에서 이용 되었다 ddH2O로 침수 미디어 및 505-560 nm의 방출 필터 설정 없음 다중 침수 목표. Confocal 그림 4 x 4, 4 × 5, 또는 5 x 5 단 수 이미지 타일 스캔 망막 크기에 따라 통해 결합으로 구성 됩니다. 7. 그 부분의 Zebrafish 망막 참고: zebrafish 망막의 그 섹션에 대 한 준비는 조직 단계 4.5까지 프로토콜에 설명 된 대로 하 고 나중에 직접 단계로 7.1 건너뜁니다. Enucleated 눈 (4.5 단계) 후 1 x PBS에 5 분 동안 두 번 씻는 다. 그 후, 70% 에탄올 (EtOH)로 조직 전송. 이 시점에서, 준비 된 눈 4 ° C에 파라핀 포함까지 저장할 수 있습니다. 조직 파라핀 포함 하기 전에 탈수를 다음과 같은 방법으로 세척: 80% 에탄올, 90% 에탄올, 96% 에탄올, 99% 에탄올, acetone/99% 에탄올 (1:2), 아세톤에 3 x 15 분에서에서 2 x 15 분에서에서 3 x 15 분에서에서 3 x 15 분에서에서 2 x 15 분에서에서 2 x 15 분. 유지 조직 파라핀 62 ° C에서 하룻밤. 62 ° c 신선한 파라핀을 열 고 포함 금형에 부 어 합니다. 원하는 섹션에 대 한 빠른 속도로, 눈의 제어 올바른 방향에서 그리고 직접 금형에 조직을 전송. 그 후, 형과 커버 추가 온수 파라핀 포함 카세트를 적용 됩니다. 파라핀 블록 냉각 후 포함 금형을 제거 합니다. 파라핀 블록 한 톰에 10 µ m 섹션으로 잘라내어 그들을 밖으로 완전히 평평 하 게 그들을 위해 충분히 물 표면에 45 ° C 물 욕조에 플 로트. 유리 슬라이드에 섹션을 수직으로 45 ° c.에 오븐에 하룻밤 건조 하기 전에 과잉의 물을 제거에 그들을 배수합니다 프로세스 섹션 추가 deparaffinize에 다음 일정 및 그 얼룩: xylol, 99% 에탄올, 96% 에탄올, 1 x 1 분 80% 에탄올, 70% 에탄올, ddH2O, 메이어의 hematoxylin에 1 x 4 분의 1 x 1 분에에서 1 x 1 분에에서에서 1 x 1 분에에서 1 x 1 분에에서 4 x 1 분 ddH2O, 0.5% 오신, 1 x 30에서에서 1x2min 1 x 10 분 ddH2O, 1 x 30 s s 80% 에탄올, 2 x 30 96% 에탄올에 s, 3 x 1 분 99% 에탄올에 xylol에 1 x 1 분. 유리 슬라이드는 xylol에서가지고 고 신속 하 게 미디어를 탑재와 조직 커버. 완전히 건조, 다음는 coverslip 위에 놓고 봉인 얼룩진된 조직 조직 하도록 하지 마십시오.

Representative Results

여기 성인 tg(fli:EGFP) zebrafish에 망막 맥 관 구조의 두 가지 일반적인 형태학 예 설명: 일단 시각 형광 현미경 (그림 9A)와 함께 한 번 confocal 레이저 스캐닝 현미경 (그림 9B). 밝혀 망막 구조 높은 조직 패턴을 보여 줍니다. 형광 현미경 시각 때 강한 autofluorescence zebrafish 망막에서 볼 수 있다. 따라서, 공초점 검사를 통해 혈관 층만의 시각화 배경 형광 감소와 대비를 증가 하도록 조언 된다. 빠른 그림 수집 또는 충분히 질적 데이터 되는 상황, 형광 현미경 매력적인 대안 이다. 그림 9: 성인 tg(fli:EGFP) zebrafish 망막 맥 관 구조의 대표 사진. 망막 맥 관 구조의 두 가지 일반적인 형태학 예 같습니다: 중앙 광섬유 동맥 아케이드의 연속으로 다음 분기 5-7 주요 혈관으로 확산. 모든 더 선박 각 꽃잎의 바깥 부분을 제한 원주 정 맥 (CV)으로 배출. 확대 (A)x 2.5에서 형광 현미경 검사 법을 통해 시각화. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 결합된 5 x 5 단일 이미지 타일 스캔 (B)를통해에 의해 망막 맥 관 구조의 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 광섬유 동맥 망막 시 신경 머리에 관통 하 고, 대부분의 샘플에 5-7 주요 혈관 (그림 10A)으로 확산. 다음 주요 혈관 아케이드의 연속으로 분기 하 고 광섬유 측근 (IOC), 원주 정 맥 (CV), 라고도 플랫 탑재 된 망막의 주변에 있는 광학 디스크를 포위 망에 연결 ( 그림 10B참조). IOC 빼낸 눈 글로브 (bulbus 륜)의 내부 테두리에 동맥 혈액 정 맥 배 이다. Zebrafish 망막 맥 관 구조는 또한 모세 혈관과 신생 (그림 10C)을 돋 아의 분기 높은 혈관 활동의 영역이 표시 됩니다. 이 혈관 활동은 IOC에 가까운 근접에서 주로 놓인 다. 동일한 눈 망막의 다른 지역에서 모두 높고 낮은 혈관 활동을 보여줄 수 있는 예 고 하는 것이 중요 하다 ( 그림 10B와 10C 그림비교). 일반적으로 제 브라의 망막 맥 관 구조는 avascular 공간 더 및 주요 지점, 예를 들어 마우스17의 망막에 비교 하는 경우 사이 적은 모세 혈관을 보여줍니다. 각 샘플의 두 눈은 맥 관 구조 사이 다를 수 있습니다 있기 때문에 단 수 검사 편견으로 이어질 수 있습니다 분석 되어야 합니다. 그림 10: 성인 tg(fli:EGFP) zebrafish 망막 맥 관 구조 시각화의 영역을 확대. 주요 혈관 (A)으로 분기 하는 광섬유 동맥. 그림 (B)의 밑에 내부 광학 원 (IOC)에 연결 하는 낮은 혈관 활동의 영역에서 망막 모세 혈관. IOC (C)에 연결 하는 높은 혈관 활동의 영역에서 망막 모세 혈관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 신경 층의 높은 보존 아키텍처는 이미 약 72 h에서 zebrafish에 존재 게시물 수정 (hpf) 이후18. 성인 zebrafish 망막 안쪽으로 (그림 11)에서 다음 레이어를 보여줍니다: 신경 절 세포 층 (GCL), 내부 plexiform 레이어 (IPL), 안 핵 층 (INL), 외부 plexiform 레이어 (OPL), 외부 핵 층 (ONL), 포토 리셉터 레이어 (PL), 그리고 망막 안료 상피 (RPE)입니다. 망막 맥 관 구조 시각화에서 혈관 매개 변수 추정은 그림 12에 표시 됩니다. 내부 망막 맥 관 구조는 안 하는 동안 신경 절의 세포 레이어 (GCL) (그림 13B, 흰색 상자)에 위치 하 고 모세 혈관 망막 안료 상피 (RPE)와 관련 된 것. 그림 11: 그는 성인 zebrafish 눈의 얼룩. 렌즈 (A)의 제거 후 전체 눈의 횡단면 개요. 성인 zebrafish의 망막 층 눈19 (B). PL (C)에서 자연 한계점의 표시 (검은색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

Hypoxia 유발 망막 neoangiogenesis의 모델 신생 콩나물, 총 혈관 영역 및 zebrafish²⁰에 intercapillary 거리를 감소 분기 포인트의 증가 숫자를 보여줍니다. 이러한 결과 zebrafish 쉽습니다 당뇨병 microvascular 합병증²¹, 나중에 당뇨병 성 망막 증의 주요 결과 포함 hypoxia 중재 neoangiogenesis VEGF 식에 강력 하 게 연결 되는 아이디어를 지원 합니다. Zebrafish 망막에 혈당 유발 변화는 혈관의 증가 두께 있지만²²패턴 전체를 유지. IPL과 INL²³의 두께를 감소 또한 30 일 동안 포도 당 솔루션에 침수를 번갈아 합니다. Vasculopathy의 대사 지지자로 zebrafish에 포도 당 대사 산물의 직접적인 영향 또한 이미 표시 했다. 추가 혈관 hyperbranching methylglyoxal²⁴부 화 후 zebrafish 태아의 트렁크 맥 관 구조에 관찰 되었다. 순간, 당뇨병 성 망막 증의 모든 주요 기준을 제공 하 없는 동물 모델이입니다. 초기 변화는 종종 찾을 수, 하지만 증식 당뇨 망막 질환을 진행²⁵없습니다. Zebrafish는 또한 우리만 지금까지 hypoxia 중재 neoangiogenesis 또는 혈당 유발 변화를 본 것이 정의에 빠진다. 현재 연구 결과 지원 아이디어는 zebrafish 혈당 중재 혈관 변화에 취약 하 고 동물 모델로 서 잠재적으로 증식 당뇨 망막 질환을 진행 표시 될 수 있습니다. 강도 및 혈당 중재 효과에 노출에 따라 바로 실험 모델 zebrafish 망막의 특정 지역에 국 소 빈 혈으로 이어질 수 있고 neoangiogenesis 증식 성 당뇨 망막 증의 주요 기준으로 홍보. 그러나 zebrafish 장기 microvascular 병 리 모델링 분야에서 comparably 새로운 선수는,, zebrafish에 곧 당뇨병 모델 추가 정보를 제공 및 다른 모델과 그들의 병 리 점에서 그 중요성을 명확 하 게. 예를 들어에서-십자가 tg(fli:EGFP) 라인에 레드 셔 서 적혈구와 tg(gata1a:DsRed) zebrafish의 동시에 시각화 잠재적인 안구 내부 bleedings 미래에 zebrafish 모델의 예측으로 microaneurysms를 보여주는 사용할 수 있습니다. PDR의 진행

망막 맥 관 구조는 아케이드의 연속으로 진행, 이후 평가 intervascular 거리, 분기 포인트의 번호와 전체 혈관 면적의 중앙 광학 동맥에서 거리를 관련이 있습니다. 평가 관 매개 변수에서 바이어스를 방지 하려면 방향의 포인트는 필요 합니다. IOC는 같은 구조 이며 관련성이 높은 이후 혈관 활동의 영역 직접 공간 근접에서 거짓말. 일관 된 평가 대 한 망막 스캔 IOC에 일관 된 거리와 여러 개의 직사각형 이미지 섹션으로 나눌 수 한다. 전체 망막을 분석 해야 하 고 이미지 숫자 대칭적으로 배포. Zebrafish 망막 높고 낮은 모 세관 밀도와 영역을 표시 하 고 이미지 섹션의 부동 한 배급 추가 편견으로 이어질 수 있습니다.

그림 12: 망막 맥 관 구조 시각화의 판독으로 혈관 매개 변수 예제 프레 젠 테이 션. Intervascular 거리 (빨간색 양방향 화살표) 내부 시 근처의 측정 원형 (IOC) (A). 3 분기 포인트 (빨간색 원) 근처 IOC (B). 돋 아 선박 (C)를보여주는 zebrafish 망막 맥 관 구조 확대 면적 (빨간색 상자)의 시각화. 특정 거리 (흰색 양방향 화살표) 중앙 동맥 (흰색 크로스)에서 선박 직경 측정 (D). 배 밀도 혈관 (붉은 대각선)를 오버레이하여 망막 영역 비율 (E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Intervascular 거리 측정, 하나는 표준 (그림 12A, 화이트 이중 화살표)으로 IOC에 일정 한 거리를 설정 하는 가상의 가로줄 (그림 12A, 흰색 가로줄) IOC에 평행 하 게 그릴 필요 합니다. 이 라인 추가 하 고 사람과 평균에 혈관 사이의 거리를 intervascular 거리를 같습니다. 분기 포인트 배 분할 하 고 더 이상의 혈관 루멘 지점에서 계속 될 때마다 각 이미지 내부 계산 됩니다. 또한 모세 혈관 사이의 수평 연결 포함 됩니다. 그것은 분석으로 일관 된 어떤 분기 포인트를 계산 하 고 불필요 한 편차를 줄이기 위해 전체 실험을 통해 이러한 규칙을 결정 하는 것이 중요. 혈관 돋 아 그림 12C에서 같이 망막 맥 관 구조에 영향을 평가 하기 위해 각 이미지에 계산 될 수 있는 다른 매개 변수입니다. 신생 콩나물 중앙 동맥 및 IOC와 망막의 외부 부분 근처 사이 아케이드 같은 승계를 수행 하지 않습니다. 평가 특정 혈관 직경, 오리엔테이션의 포인트 항상 필요 하다는 설정된 거리 표시 측정 자리. 망막 내 중앙 동맥의 기원 주요 줄기 혈관 (그림 12D, 크로스 백)에 대 한 이러한 지침을 제공합니다. 전체 망막 영역의 혈관 (12E 그림, 붉은 대각선)에 의해 점령 지역 혈관 밀도 이며 직접 하지 avascular 영역에 연결 합니다.

한 샘플의 완전 한 공초점 레이저 스캔 작은 모 세관 hypersprouting의 시각화 수 있도록 여러 높은 세부 그림의 구성 해야 합니다. 이 단계에 자원과 시간을 최적화 하려면 모든 타일에 대 한 자동화 된 경작 절차 일반 스캔 깊이 함께 사용 해야 합니다. 망막의 고르지 못한 장착 크게 confocal 현미경으로는 맥 관 구조를 검사 하는 시간을 늘릴 수 있습니다. 하나는 GCL의 부분 포함 하지만 혈관 레이어 (그림 13B, 흰색 상자), 검색 하 고 싶습니다 최적의 접근에는 경우가 많습니다.후 너무 짧은 되 고 플랫-마운트 달성 하기 상처 뿐만 아니라 자르기, 시 신경의 초과 길이 떠나 고르지 장착 될 수 있습니다.

그림 13: 그 얼룩이 지 고 성인 zebrafish 망막에 autofluorescence의 비교. GCL (A)위에 초점에 맥 하 관 망막 구조 망막 맥 관 구조 (흰색 상자) 보여주는 녹색 EGFP 신호 하 고 망막 층 전시 강한 autofluorescence (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Zebrafish 망막 맥 관 구조에 대 한 적절 한 준비는 사전 훈련을 필요로, 일반인된 dissectors와 강하게 다양 한 준비 결과 작은 샘플 크기는 기술의 주요 제한. 동안 tg(fli:EGFP) zebrafish 눈의 준비는 맥 관 구조 상태에 대 한 통찰력을 제공, 기술 숙련 된 연구원에 대 한 망막 당 작업 시간 약 20 분을 아직도 이용 한다. 해 현미경으로 모든 망막 맥 관 구조에 대 한 준비 단계를 수행 해야 합니다 그리고 머물 필요가 dissectors 집중 전체 시간으로 부주의 단계 잠재적으로 용기 파손을 일으킬 수 있다. 것은 선박 무결성을 유지 하는 것의 가능성을 감소 하는 준비에서 장기간된 부재로 정기적으로 연습 해야 합니다.

또한, immunohistochemistry (IHC)를 통해 추가 판독은 인간과 설치류 조직에 확인 하는 항 체 수가 적은 zebrafish 작업 중인로 여전히 제한 됩니다. IHC에 관심이 경험 새로운 목표와 함께 작업 하는 경우에 특히 zebrafish 특정 항 체에 대 한 검색 하도록 조언 된다. 또는, 눈에서 맥 관 구조를 넘어 셀 공부 유용한 추가 zebrafish 기자 라인을 사용 하는 것이 좋습니다. 그러나 여러 유전자 변형 기자 수행 성인 제 브라 라인을 생성 하는 몇 개월 걸리는이 전략은, 시간이 걸리고, 이다.

그럼에도 불구 하 고,는 zebrafish 장점의 포즈. 그들은 상대적으로 작은 하 고 쉽게 재현. 그들은 성인 단계를 신속 하 게 성장할 수 있고 그들의 태아는 약물 검사에 대 한 최적의. 필드 쉽게 성장 하 고 더 많은 문학 접근 되고있다. 빠른 속도와 transgene 형광 기자 라인의 풍부한 유전자 녹아웃을 생성 하는 기능, zebrafish에 대 한 선택만 선택한 연구 질문에 의해 제 지.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 카트린 베네와 마를 린 Hausner zebrafish 축산 및 기술 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 저자는 의학 및 의료 기술 임 (DFG INST 91027/9-1)는 핵심 시설 라이브 셀 이미징 임 센터에서의 지원을 인정합니다. 이 연구는 도이치 가운데에 의해 지원 되었다 (국제 연구 교육 그룹 1874/1 “DIAMICOM” 프로젝트 s p 5와 SP9; 공동 연구 센터 SFB1118, 프로젝트 B1 및 공동 연구 센터 SFB/TR23 프로젝트 Z5).

Materials

NaOH	Roth	6771.3
KCl	Merck	1.04936
CaCl_2*6H₂0	Roth	5239.2
MgSO_4*7H₂0	Merck	1.05886.0500
Paraformaldehyd	Roth	0335.3
Sodium dihydrogen phosphate	Roth	2370.1
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine)	Sigma	A5040
PBS	Roth	9143.1
Agarose	Roth	2267.3
Fluoromount-G	Thermo-Fischer	00-4958-02
Petri dish	Greiner Bio one	633180
Six-well plate	StarLab	CC7682-7506
Needle	MSG Praxisbedarf	BD 300900
Micro Tweezer	World Precision Instruments	14095
Microdissection Scissor	World Precision Instruments	501778
Glass slide	Carl Roth	H872.1
Coverslip 22mmx22mm	neoLab	103512222
Scalpel	MSG Praxisbedarf	FEA111
Epi-Illumination	Leica	10446389
Fluorescence stereomicroscope MZ10 F	Leica	NA
Confocal laser-scanning microscope SP5 DS	Leica	NA
Stereomicroscope M80	Leica	NA
Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype	NA	NA	see Reference 15
Mayer’s hematoxylin	Dr. K. Hollborn & Söhne	0088663
0.5% eosin	Dr. K. Hollborn & Söhne	NA
99,9% ethanol	Roth	9065.2
Paraffin	Merck	1,071,501,000
Xylol	Roth	4436.2
Acetone	Emsure	606-001-00-8
Microtome RM 2165	Leica	NA

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Citazione di questo articolo

Wiggenhauser, L. M., Kohl, K., Dietrich, N., Hammes, H., Kroll, J. Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature. J. Vis. Exp. (130), e56674, doi:10.3791/56674 (2017).