Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Lucas Moritz Wiggenhauser; Katharina Kohl; Nadine Dietrich; Hans-Peter Hammes; Jens Kroll

doi:10.3791/56674

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Medicina

Lo studio diabete Through the Eyes of un pesce: Microdissection, visualizzazione e analisi della tg(fli:EGFP) adulto Vasculature retinico Zebrafish

Published: December 26, 2017

doi:

10.3791/56674

Lucas Moritz Wiggenhauser¹, Katharina Kohl², Nadine Dietrich², Hans-Peter Hammes², Jens Kroll¹

¹Department of Vascular Biology and Tumorangiogenesis, Center for Biomedicine and Medical Technology Mannheim (CBTM), Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University, ²V. Medical Clinic, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University

Summary

Discutiamo qui, un protocollo di metodo che vi permetterà una facile analisi del vasculature retinico adulto tg(fli:EGFP) zebrafish come una lettura veloce nelle impostazioni delle patologie vascolari a lungo termine legate alla neoangiogenesi e cambiamenti strutturali.

Abstract

La retinopatia diabetica è la principale causa di cecità fra gli adulti di mezza età. La crescente prevalenza del diabete in tutto il mondo farà la prevenzione delle complicazioni microvascolari diabetiche uno dei settori chiave della ricerca dei prossimi decenni. Terapia specializzata, mirata e droghe terapeutiche novelle sono necessarie per gestire il crescente numero di pazienti a rischio di perdita di visione. Zebrafish è un modello animale stabilito per le domande di ricerca inerente allo sviluppo con l’aumento di rilevanza per la modellazione di processi metabolici di malattia multifattoriale. I vantaggi della specie consentono una visualizzazione ottimale e approcci, combinati con la forte capacità di sfondamento di geni di interesse di screening di stupefacenti a resa elevata. Qui, descriviamo un protocollo che permetterà di facilitare l’analisi del vasculature retinico adulto tg(fli:EGFP) zebrafish come una lettura veloce nelle impostazioni delle patologie vascolari a lungo termine collegate a danno di neoangiogenesi o nave. Questo risultato è ottenuto tramite la dissezione della retina zebrafish e intero-montaggio del tessuto. Visualizzazione dei vasi esposti è quindi ottenuta tramite microscopia confocale del reporter EGFP verde espresso nel vasculature retinico adulto. Corretta gestione del tessuto porterà a risultati migliori e meno rottura del vaso interno per assicurare la visualizzazione della struttura vascolare inalterata. Il metodo può essere utilizzato nei modelli di zebrafish di vasculopatia retinica collegata ai cambiamenti nell’architettura della nave, nonché di neoangiogenesi.

Introduction

Il diabete mellito è una malattia metabolica definita dall’iperglicemia derivanti dalla secrezione di insulina disfunzionali o risposta inadeguata dei tessuti ad insulina secreta. L’OMS stima che 422 milioni di adulti erano affette da diabete mellito in 2014¹ e la prevalenza del diabete in tutto il mondo è destinata ad aumentare a 8-10% della popolazione fino al 2035², rendendo diabete uno dei settori chiave della ricerca nella prossimi decenni. Vivere con alta glicemia cronica conduce alle complicazioni microvascolari a lungo termine, compreso la polineuropatia, la nefropatia e la retinopatia diabetica. La gestione e la prevenzione di queste complicazioni sono difficili; Infatti, il diabete sta diventando la causa più frequente della malattia renale di stadio finale (ESRD), che conduce alla dialisi², e il diabete è la principale causa di cecità fra gli adulti di mezza età³.

Le cause iniziali di danno microvascolare in occhio diabetico sono iperglicemia cronica, alterazioni metaboliche, nonché a determinati fattori di rischio (ad es., ipertensione, dislipidemia), che conducono alla disfunzione endoteliale vascolare, Pericita dropout, e regressione capillare che si traduce in maniche vascolare acellulare. La risultante ischemia retinica è la causa della neovascolarizzazione e aumento della permeabilità vascolare promuovendo lo sviluppo di retinopatia diabetica proliferativa (PDR)⁴. Retinopatia diabetica generalmente è stata rilevata nel 37% dei pazienti affetti da diabete, mentre avvistare-minacciosa la retinopatia diabetica è stata accertata nel 12% della coorte europea bianco schermato in UKADS Studio⁵. Il trattamento attuale può solo impedire ulteriori complicazioni e non è in grado di ripristinare completamente il danno già indotto. Il photocoagulation di panretinal, oltre al controllo glicemico, è la terapia standard per retinopatia diabetica proliferative (PDR) ma colpisce il tessuto sano adiacente pure. Gli interventi anti-VEGF mostrano risultati promettenti come alternative al laser trattamento⁶^,⁷, ma in ultima analisi, terapia specializzata, mirata e nuovi farmaci sono necessari per gestire il crescente numero di pazienti a rischio di perdita di visione.

I modelli di ricerca animale di retinopatia diabetica non condividono tutti gli aspetti della fisiopatologia umana. L’utilizzazione delle specie corretta per soddisfare i requisiti specifici della questione ricerca scientifica è una delle parti più notevoli del setup sperimentale. L’embrione di pesce zebra (Danio rerio) è già ampiamente usato nella ricerca inerente allo sviluppo e fornisce uno sfondo di pratico ottimo per atterramento o knockout specifici geni via morpholinos o la tecnica CRISPR/Cas9⁸. Questi metodi possono essere facilmente utilizzati in zebrafish per studiare i geni, che sono stati identificati dagli studi di associazione genome-wide su larga scala (GWAS), generando visioni particolari meccanismi di progressione di malattia e di suscettibilità⁹. Breve tempo generazionale, grandi quantità di prole, facile e basso costo gestione e un crescente supporto di dosaggio hanno aumentato la rilevanza del modello zebrafish, soprattutto dato il suo grande potenziale per la modellazione di malattia metabolica. Conservazione dei meccanismi biologici in zebrafish è stato indicato come base per lo sviluppo di terapie farmacologiche. Ad esempio, la metformina della droga antidiabetica e ipocolesterolemizzante simvastatina sono stati indicati per “trattare” le condizioni in modelli di campo/desametasone-indotto alto PEPCK espressione e ricca in colesterolo ipercolesterolemia indotta da dieta¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹². questa intuizione avanza in overarching meccanismi metabolici conservati è ulteriormente supportata dal crescente numero di modelli di diabete di zebrafish, attraverso esperimenti come: alternando incubazione in soluzioni di glucosio, Streptozotocin-indotti ablazione delle cellule beta, ablazione nitroreductase-mediata delle cellule beta utilizzando il metronidazolo profarmaco, diabete monogenico mediato via atterramento gene pdx1 o ad eliminazione diretta, nonché modelli di resistenza di insulina aumentata in muscolo scheletrico ¹². questi già stabiliti i protocolli, le specifiche di cui sopra della specie, e la capacità di manipolare in modo efficiente il genoma in un gran numero di campioni tutti dimostrare i vantaggi di zebrafish per studiare i meccanismi Guida di processi complessi di malattia come pure la capacità alla schermata per interventi farmacologici.

Una conoscenza generale dell’anatomia dell’occhio zebrafish base (Figura 1) è necessaria per il dissettore per utilizzare zebrafish come modello per Angiopatia retinica. L’occhio di zebrafish ha sei muscoli estrinseci, quattro retto e due muscoli obliqui che inserire sulla parte esterna del globo a sclera¹³. La cornea è il tessuto trasparente che copre la lente e continua direttamente nella sclera, che costituisce il guscio esterno dell’occhio. La sclera non è trasparente, ha una superficie riflettente parzialmente chiaro ed è fortemente pigmentata. Lo stesso obiettivo è più sferica rispetto alla controparte umana. La retina è costituita da tre strati nucleari delle cellule neuronali mentre il vasculature retinico fornendo ossigeno è associato molto attentamente con lo strato delle cellule del ganglio interna ma non forma una rete subretinal. Vasi coroideali, al contrario, si trovano tra la sclera e la retina e sono associati con l’epitelio pigmentato retinico (RPE). Questa rete capillare fornisce ossigeno alla parte esterne della retina¹⁴.

Figura 1: rappresentazione schematica dell’occhio adulto zebrafish. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Semplice visualizzazione del vasculature retinico può avvenire tramite utilizzazione del zebrafish transgenici tg(fli:EGFP) linea¹⁵. La proteina fluorescente verde espressa sotto il controllo del promotore fli in cellule endoteliali del sistema vascolare è la base per la visualizzazione tramite un microscopio in successivi passaggi di scansione laser. Questo risultato è ottenuto tramite la dissezione della retina zebrafish e intero-montaggio del tessuto. Questo modello transgenico consente una lettura veloce vascolare senza alcuna applicazione di etichettatura intravascolare o intero-monta immunohistochemistry. Per analizzare la retinopatia diabetica in zebrafish, una routine di preparazione passo dopo passo e standardizzato deve essere utilizzata da ogni dissettore.Il seguente protocollo di preparazione fornisce altri gruppi di ricerca la possibilità di valutare facilmente i cambiamenti vascolari nei vasi esposti dell’occhio adulto zebrafish e fornire indicazioni per stabilire una routine di dissezione ottimizzata per la retina di zebrafish.

Protocol

Tutte le procedure, inclusi i passaggi relativi a soggetti animali, sono state approvate dal comitato etico di animali (Regierungspräsidium Karlsruhe) e seguono le indicazioni di cura degli animali dell’Università di Heidelberg. 1. preparazione di fissativo (4% PFA/PBS) Preparare il fissativo fresco ogni giorno per garantire una conservazione ottimale di integrità istologica del tessuto. Sciogliere 0,2 g di idrossido di sodio (NaOH) in 90 mL d’acqua distillata doppia (ddH2O) mescolando costantemente a temperatura ambiente. Aggiungere paraformaldeide 4 g (PFA) e mescolare fino a quando la soluzione è completamente chiara per almeno 5-10 min per assicurare la depolimerizzazione delle macromolecole.Attenzione: PFA è tossico, maneggiare con cura. Sciogliere 0,84 g di fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4) nella soluzione e controllo pH a 7,2 via la misura. Regolare il volume a 100 mL con ddH2O e filtrare la soluzione attraverso carta da filtro di grado 3. Memorizzare 4% PFA/PBS sul ghiaccio. 2. preparazione della soluzione per l’eutanasia Nota: I seguenti passaggi sono stati fatti con ceppo selvaggio-tipo zebrafish ABTL in generale età di 6-8 lun. Utilizzare solfonato di metano 3-aminobenzoate etilico, anche denominato “tricaina” o MS-222, in una concentrazione di 0,31 mg/mL per zebrafish eutanasia16. Utilizzare 1 x uovo acqua, utilizzato per generare embrioni di zebrafish, come solvente per la soluzione di eutanasia. In generale, controllare la profondità di anestesia corretta prima di lavorare con pesce sedato dimostrando la perdita di equilibrio e perdita di reazione di tocco. Per raggiungere 1.000 mL di 10 x acqua di uovo, aggiungere questi sali 1.000 mL d’acqua distillata doppia (ddH2O) mescolando costantemente nell’ordine seguente: 10 g NaCl, 0,3 g di KCl, 0,4 g CaCl2 *6 H2O, 1,32 g MgSO4 *6 H2O. 3. fissazione del tessuto di Zebrafish Trasferire 6 mL 4% PFA/PBS soluzione per campione nei pozzetti di piastre da 6 pozzetti in anticipo. Eutanasia di zebrafish adulto (in precedenza su un ciclo standard di luce-giorno, per esempio, 12 h: 12 h) 2 h dopo luci accendere la mattina, inserendoli nella soluzione tricaina e attendere fino a quando non hanno raggiunto l’eutanasia. A seguito della cessazione del movimento opercolare, che può richiedere fino a 10 min. Prendere il pesce fuori della soluzione di eutanasia di tricaina e metterli sui tovaglioli di carta nuova. Asciugate il pesce e utilizzare un bisturi per tagliare la testa dietro l’opercolo (Vedi Figura 2A). Trasferire i capi direttamente nei piatti ben preparati, che contengono il fissativo preparato al momento. Negozio le piastre a pozzetti contenenti le teste dei pesci a 4 ° C durante la notte per almeno 24 h assicurare il fissativo penetra gli strati più profondi della retina.Nota: Zebrafish teste possono essere memorizzate per un massimo di 48 h in 1x tamponato fosfato salino (PBS) a 4 ° C prima della preparazione senza una rilevante perdita di potenza del segnale di fluorescenza. Aumento della latenza può portare alla perdita di integrità del tessuto e riduce la qualità dell’immagine e così dovrebbe essere evitato. 4. preparazione del Vasculature retinico di Zebrafish Riempire una scatola di Petri fino ad un terzo con riscaldata agarosio al 2% e attendere che l’agar è ferma. Coprire la piastra di agar con 1x PBS per creare un’area di lavoro per sezionare gli occhi.Nota: Questo permetterà sia conservazione di pinzette di preparazione e di bassa pressione sul tessuto durante la dissezione, riducendo la probabilità di danni strutturali. Tutti gli ulteriori passaggi di preparazione devono essere eseguiti in questa area di lavoro utilizzando il forcipe dritto #5 con estremità sottili sotto un microscopio per dissezione con epi-illuminazione aggiuntiva. Durante la dissezione, utilizzare ingrandimento tra 4.0 x e 6.0 x per consentire sia panoramica e valutazione particolare-orientato del tessuto. Trasferire il campione fisso nella piastra di petri e, tenendo la testa alla superficie del taglio con una pinzetta, inserire un’altra pinzetta appuntato-insieme sotto il bulbo oculare alla cavità orbitale. Lentamente aprire la pinzetta sotto l’occhio e afferrare il nervo ottico, quindi attentamente strappare e staccare gli occhi (Figura 2B). Figura 2: rimozione dell’occhio adulto zebrafish. Vista laterale della cornea con l’occhio ancora nella cavità orbitale e intatta del nervo ottico (A). Vista laterale della cornea con occhio distaccato (B). Rappresentazione schematica dell’occhio zebrafish questo passaggio (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Rimuovere qualsiasi il rectus quattro e due muscoli extraocular obliqui che sono ancora connessi a occhio come pure il tessuto extraoculare residuo che connette l’occhio alla cavità orbitale (confronta Figura 3 e Figura 4). Tale scopo trattenendo l’occhio attraverso una pinzetta socchiusi e, presa la struttura con altre la pinzetta, morbidamente strappero ‘ con un movimento diametrale. Poiché il bulbo oculare di presa direttamente conduce alla rottura del vaso interno, questa tecnica è opportunamente delicata per preservare il sistema vascolare. Figura 3: occhio di zebrafish adulto con muscoli extraocular nella messa a fuoco. Vista laterale con allegato di un muscolo extraocular al bordo esterno sinistro del globo oculare a fuoco (A). Nervo ottico vista laterale con muscoli extraocular simmetricamente che fiancheggiano il nervo ottico (B). Rappresentazione schematica dell’occhio zebrafish questo passaggio (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Usi un ago monouso 27G (0.4 x 19 mm) per perforare la cornea (Figura 4, freccia rossa) al campo esterno. Attraverso questa apertura tenere la cornea con entrambe le pinzette e strapparlo leggermente aperta. In seguito attentamente lavorano per creare una lacrima centrata approssimativamente la dimensione della pupilla rispettiva. Figura 4: occhio di zebrafish adulto dopo la rimozione di tutti i muscoli extraocular. Vista laterale con il bordo esterno sgomberato dell’oculare globo visibile (A).Nervo ottico vista laterale con il nervo ottico nel mezzo. La sclera che riflettono la luce non copra tutta l’area intorno al nervo (linea rossa tratteggiata) (B). Rappresentazione schematica dell’occhio zebrafish questo passaggio (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Applicare una pressione sul lato cornea del globo oculare (bulbus oculi) al bordo esterno della cornea sopra l’iride. Questo creerà una piccola ammaccatura e spingere la lente all’altezza della lacerazione cornea. Eseguire le pinzette sotto la lente e rimuoverlo (Figura 5A). Figura 5: occhio di zebrafish adulto nel processo di rimozione della lente. Vista laterale della cornea con la lente spinto attraverso la lacerazione corneale (A). Vista laterale della cornea con la lente al lato del globo oculare (B). Rappresentazione schematica dell’occhio zebrafish questo passaggio (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Accende l’occhio upside-down al nervo ottico il ricercatore di fronte. Si noti che la sclera e della cornea sono collegati e formano la tunica fibrosa del bulbo oculare per proteggere la retina a forma di Coppa. (Figura 6). Questo guscio, che consiste della cornea e sclera, è chiamato anche “corneosclera” e pezzi di ricambio la zona intorno al nervo ottico (fig. 4B, linea rossa tratteggiata). Inserire un ago a questa sospensione una volta per creare un’apertura tra la sclera e la retina. Figura 6: Corneosclera composto da sclera e cornea, che è staccato dal restante tessuto intraoculare. Vista di lato corneale che mostra la continuazione della cornea traslucida nella sclera pigmentata (A). Vista laterale focalizzata sulla parte scleral di corneosclera (B). Raffigurazione schematica del corneosclera rimosso (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Utilizzando questo accesso con entrambe le pinzette, attentamente di strappare la sclera assialmente in strisce per aumentare l’apertura intorno al nervo ottico. Prestare attenzione a mantenere intatta la corneosclera alla transizione alla circonferenza corneale laterale (Vedi Figura 6A). Tenere la sclera con una pinzetta e, afferrando il nervo ottico con l’altro e totalmente tirando via, rimuovere il corneosclera dall’occhio e scartarla (Figura 6). Provare recidere le connessioni prima di separarsi il corneosclera e il restante tessuto intraoculare, come allegato ad altre strutture saranno un punto critico; Questo passaggio fornirà una struttura a forma di Coppa, che consiste della coroide e della retina che contiene il sistema vascolare retinico (Figura 7). Creare una rottura nello strato coroidico/RPE tenendo un ago 27G lateralmente per il restante tazza mentre raschiando la superficie esterna con il bordo della punta dell’ago. Utilizzare la rottura come punto di accesso per ottenere una presa sullo strato coroidico/RPE e copiarlo con entrambe le pinzette in strisce, ma mantenere intatta la connessione per l’iride. In seguito, eseguire una pinzetta sotto l’iride e andare in giro in un circuito dall’esterno durante la creazione di tensione tirando a livello coroideale/RPE fuori produzione per ottenere il distacco della struttura combinata.Nota: L’iride deve essere scollegata, in modo da non ostruire la fluorescenza durante la visualizzazione dei vasi (Figura 8B). Afferrando l’iride direttamente per rimuoverlo può portare a danno del vaso ampio, soprattutto al circolo ottico interno (IOC), dal momento che l’iride è ancora collegata al tessuto circostante. Lo strato coroidico e dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) possono essere separati e spesso mantenere una connessione per l’iride, che permette una facile rimozione secondaria. Se parti dell’iride non possono essere rimosso, è possibile utilizzare un punto di rottura naturale che dell’occhio di zebrafish adulto esibisce all’interno dello strato dei fotorecettori (PL), in modo simile al punto 4.9, rimuovere l’iride. Raschiare oltre la parte esterna della retina a forma di tazza rimanente per indurre le sospensioni con il PL sopra il punto di rottura (Figura 11, freccia nera). Utilizzare l’accesso creato per rimuovere la parte superiore del livello pur mantenendo intatta la possibilità di connessione per l’iride. In seguito, eseguire le pinzette sotto l’iride e andare in giro in un circuito come accennato prima di staccare la struttura combinata.Nota: Uno dovrebbe esercitare la pazienza come il passo intero 4.9 può essere difficile, ma questa cura raggiungerà un risultato migliore vascolare rispetto semplicemente afferrando l’iride a bordo della pupilla o forzando un’apertura distruggendo connessioni al coroidico/RPE o strato di fotoricettore senza loro rispettivi rimozione. Seguendo questo passaggio sarà così preservare integrità vascolare retinica, ma portare a danni degli strati retinici esterni. Figura 7: occhio di zebrafish adulto dopo la rimozione della corneosclera. Vista laterale Mostra il tessuto restante intraoculare con intatto iride e del nervo ottico (A). Vista laterale della cornea con iris a fuoco (B). Rappresentazione schematica dell’occhio zebrafish questo passaggio (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Utilizzare una forbice di primavera di microdissection con un bordo di taglio dritto 2,5 mm per tagliare il nervo ottico più vicino possibile alla retina; Ciò consentirà un migliore piatto-montaggio del tessuto. Figura 8: occhio di zebrafish adulto dopo la rimozione del tronco del nervo ottico e RPE/choroid. Vista laterale del nervo ottico Mostra la retina con un tronco del nervo ottico (A). Vista laterale della cornea con uno sguardo diretto sullo strato più interno della retina (B). Rappresentazione schematica dell’occhio zebrafish questo passaggio (C).Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 5. montaggio del Vasculature retinico Lavare la retina dissecata due volte per 5 minuti in PBS 1X. Per trasferire la retina dopo il troncamento del nervo ottico, utilizzare una spatola di laboratorio con una fine micro cucchiaio per evitare la manipolazione diretta del tessuto esposto. Mettere una goccia di PBS su un vetrino e trasferire la retina nella goccia. Utilizzare una pinzetta per mantenere il tessuto sul posto durante il taglio la struttura a forma di Coppa con un bisturi per creare una forma piatta petalo di quattro o cinque petali a seconda delle dimensioni della retina (Vedi Figura 9). Aspirare il PBS avanzo con un bel pezzo di carta. Fare attenzione a non toccare la retina. Cappotto della retina piatto montato in mezzi di montaggio e coprire con un vetrino coprioggetti. Essere attenti a non creare schiuma, come bolle d’aria possono falsare la visualizzazione dei vasi retinici. Ridurre al minimo movimento del coprivetrino e sigillare il coperchio con smalto trasparente. 6. Visualizzazione del Vasculature retinico Mantenere il divario di tempo tra la preparazione e la visualizzazione più breve possibile per ridurre la perdita di dettaglio immagine attraverso la perdita di segnale di fluorescenza. Conservare i supporti di sistema vascolare retinico preparati a 4 ° C per ridurre la perdita di segnale, se non è possibile la visualizzazione diretta, come degradazione della qualità dell’immagine diventa lentamente visibile 48 h dopo la preparazione. Visualizzare i supporti del sistema vascolare retinico tramite microscopia a fluorescenza o microscopia confocale del laser.Nota: Visualizzazione di nave da microscopia di fluorescenza è stata realizzata a 2,5 ingrandimenti con un tempo di esposizione di 2,0 s, guadagno di 6,0 x e gamma impostazioni di 1.67. Per la microscopia confocale, un Ar-laser (488 nm/20 mW) al 20% di potenza viene utilizzato in combinazione con un filtro di eccitazione TD 488/543/633, un 20 x / 0,7 NA multi-obiettivo per immersione con ddH2O come immersione media e le impostazioni del filtro di emissione di 505-560 nm. Immagini confocal sono composti da 4 x 4, 4 x 5 o 5 x 5 immagini singolari combinate attraverso una scansione di piastrelle a seconda delle dimensioni della retina. 7. HE sezioni della Retina Zebrafish Nota: Per le sezioni di HE della retina zebrafish, preparare il tessuto come descritto nel protocollo fino al punto 4.5 e in seguito passare direttamente al punto 7.1. Lavare gli occhi enucleated (dopo passo 4.5) due volte per 5 minuti in PBS 1X. In seguito, è possibile trasferire il tessuto in 70% di etanolo (EtOH). A questo punto, occhi preparati possono essere conservati a 4 ° C fino inclusione in paraffina. Lavare il tessuto il seguente modo per disidratare e prima inclusione in paraffina: 2 x 15 min in etanolo di 80%, 2 x 15 min in etanolo al 90%, 3 x 15 min in etanolo al 96%, 3 x 15 min in etanolo al 99%, 2 x 15 min in etanolo di acetone/99% (1:2), 3 x 15 min in acetone. Mantenere il tessuto in paraffina a 62 ° C durante la notte. Scalda paraffina fresco a 62 ° C e versare in stampi di incorporamento. Trasferire il tessuto negli stampi direttamente e, ad un ritmo veloce, controllo corretto orientamento degli occhi della sezione desiderata. In seguito, applicare una cassetta incasso al stampo e coprire con ulteriore paraffina riscaldata. Rimuovere l’incorporamento stampi dopo blocchi di paraffina si sono raffreddati. Tagliare i blocchi di paraffina presso un microtomo a 10 µm sezioni e galleggiare fuori su un bagno di acqua 45 ° C sulla superficie dell’acqua abbastanza a lungo per loro appiattire completamente. Prendere le sezioni su un vetrino e scolarli verticalmente per rimuovere l’acqua in eccesso prima di asciugare durante la notte in un forno a 45 ° C. Processo le sezioni più ulteriormente con il seguente calendario per deparaffinizzare e macchia di HE: 4 x 1 min in xilolo, 1 x 1 min in etanolo al 99%, 1 x 1 min in etanolo al 96%, 1 x 1 min in etanolo di 80%, 1 x 1 min in etanolo al 70%, 1 x 1 min in ddH2O, 1 x 4 min in ematossilina di Mayer , 1 x 10 min in ddH2O, 1x2min in eosina 0,5%, 1 x 30 s in ddH2O, 1 x 30 s in 80% etanolo, 2 x 30 s in etanolo al 96%, 3 x 1 min in etanolo al 99% e 1 x 1 min in xilolo. Prendere il vetrino fuori il xilolo e coprire rapidamente il tessuto con supporti di montaggio. Evitare di lasciare che il tessuto asciughi completamente, quindi adagiarvi un vetrino coprioggetto e sigillare il tessuto macchiato.

Representative Results

Qui dimostriamo due esempi tipici morfologici del vasculature retinico in zebrafish adulto tg(fli:EGFP): una volta visualizzato con un microscopio a fluorescenza (Figura 9A) e una volta con un laser confocale a scansione microscopio (figura 9B). La struttura retinica rivelata Mostra un modello altamente organizzato. Forte autofluorescenza è visto nella retina zebrafish, quando visualizzato con un microscopio a fluorescenza. Dunque, una visualizzazione del solo livello vascolare tramite una scansione confocale è consigliata di ridurre la fluorescenza di fondo ed aumentare il contrasto. Acquisizione di foto e situazioni in cui i dati qualitativi sono abbastanza più rapida, il microscopio a fluorescenza è un’alternativa attraente. Figura 9: immagini rappresentative del sistema vascolare retinico di zebrafish adulto tg(fli:EGFP). Sono mostrati due esempi tipici morfologici del vasculature retinico: l’arteria ottica centrale si diffonde nei vasi principali 5-7, che poi la diramazione in un susseguirsi di portici. Tutte le maggiori navi drenaggio nella vena della circonferenza (CV) limitando la parte esterna di ogni petalo. Visualizzazione tramite microscopia a fluorescenza a 2,5 x ingrandimento (A). Visualizzazione del vasculature retinico di laser confocale microscopia attraverso una scansione di mattonelle di 5 x 5 singola immagine combinata (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. L’arteria ottica penetra la retina alla testa del nervo ottico e, nella maggior parte dei campioni, si diffonde in 5-7 vasi principali (Figura 10A). I vasi principali quindi la diramazione in un susseguirsi di portici e connettersi a ottico cerchio interno (IOC), chiamato anche la vena della circonferenza (CV), che circondano il disco ottico nella periferia della retina montata piatta (Vedi figura 10B). Il cio è il vaso venoso che drena il sangue arterioso al bordo interno del globo oculare (bulbus oculi). Il sistema vascolare retinico di zebrafish Mostra anche aree di elevata attività vascolare con ramificazione dei capillari e angiogenici germogliatura (Figura 10). Questa attività vascolare è per lo più situata nei pressi del cio. È importante notare che lo stesso occhio può dimostrare sia alta e bassa vascolare attività in diverse regioni della retina (confronta figura 10B e Figura 10). In generale, il sistema vascolare retinico di zebrafish Mostra avascular più spazio e meno capillari tra i rami principali rispetto a, per esempio, la retina di topi17. Entrambi gli occhi di ogni campione devono essere analizzati perché il sistema vascolare può variare in mezzo e singolare ispezione può portare a pregiudizi. Figura 10: ingrandita aree di visualizzazione di sistema vascolare retinico zebrafish adulto tg(fli:EGFP). L’arteria ottica ramificazione in vasi principali (A). Capillari retinici in un’area di bassa attività vascolare collegamento parte della cerchia di ottica (IOC) nella parte inferiore dell’immagine (B). Capillari retinici in un’area di alta attività vascolare collegamento allo IOC (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Un’architettura altamente conservata di un neurone strati è già presente in zebrafish da circa 72 h post fertilizzazione (hpf) in poi18. La retina di zebrafish adulto Mostra i seguenti strati dall’interno verso l’esterno (Figura 11): strato delle cellule del ganglio (GCL), strato plessiforme interno (IPL), strato nucleare interno (INL), strato plexiform esterno (OPL), strato nucleare esterno (ONL), strato di fotoricettore (PL), e l’epitelio pigmentato retinico (RPE). La stima dei parametri vascolari da visualizzazione sistema vascolare retinico è illustrata nella Figura 12. Sistema vascolare retinico interno è situato sul livello delle cellule del ganglio (GCL) (Figura 13B, scatola bianca) mentre il coroidico capillari sarebbe associati con l’epitelio pigmentato retinico (RPE). Figura 11: egli macchiatura dell’occhio adulto zebrafish. Panoramica della sezione trasversale dell’occhio intero dopo la rimozione della lente (A). Strati retinici di zebrafish adulto eye19 (B). Indicazione (freccia nera) del naturale punto di rottura in PL (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Modelli di neoangiogenesi retinica indotta da ipossia mostrano numeri aumentati dei punti di ramificazione, angiogenico germoglia, area vascolare totale e diminuito intercapillary distanza in zebrafish²⁰. Questi risultati supportano l’idea che il pesce zebra è suscettibile di complicazioni microvascolari diabetiche²¹, come risultati chiave di successivamente retinopatia diabetica includono neoangiogenesi ipossia-mediata, che è fortemente legata alla espressione di VEGF. Cambiamenti indotti dall’iperglicemia nella retina zebrafish portano a spessore maggiorato delle navi ma mantengono la totale patterning²². Alternando l’immersione in soluzioni di glucosio per 30 giorni anche diminuisce lo spessore del IPL e INL²³. L’influenza diretta di metaboliti del glucosio in zebrafish come metabolici fautori di vasculopathy anche già è stato indicato. Ulteriori hyperbranching vascolare è stata osservata nel vasculature tronco di embrioni di zebrafish dopo incubazione con methylglyoxal²⁴. Al momento, non c’è nessun modello animale che fornisce tutti i criteri chiavi di retinopatia diabetica. Cambiamenti in anticipo si trovano spesso, ma la progressione di retinopatia diabetica proliferativa manca²⁵. Zebrafish cade anche in questa definizione, come abbiamo visto solo neoangiogenesi ipossia-mediata o cambiamenti indotti dall’iperglicemia fino ad ora. I risultati attuali sostengono l’idea che il pesce zebra è suscettibile di cambiamenti vascolari iperglicemia-mediata e come modello animale potenzialmente può mostrare una progressione di retinopatia diabetica proliferativa. A seconda della forza e l’esposizione all’effetto di iperglicemia-mediata, il modello proprio sperimentale potrebbe condurre ad ischemia in determinate aree della retina zebrafish e promuovere neoangiogenesi come i criteri chiave di retinopatia diabetica proliferativa. Tuttavia, come zebrafish è un giocatore relativamente nuovo nel campo della modellazione a lungo termine patologie microvascolari, diabete prossimi modelli in zebrafish saranno fornire ulteriori informazioni e chiarire la sua importanza rispetto ad altri modelli e le loro patologie. Ad esempio, una in-croce di tg(gata1a:DsRed) zebrafish con eritrociti rosso-etichettati nella linea tg(fli:EGFP) potrebbe essere utilizzata contemporaneamente visualizzare i potenziali emorragie intraoculari in futuro modelli di zebrafish risultati microaneurismi come un predittore di progressione di PDR.

Poiché il sistema vascolare retinico progredisce in una successione di arcate, valutazione della distanza intervascular, numero dei punti di ramificazione e l’area vascolare totale sono correlati alla distanza dall’arteria ottica centrale. Per evitare pregiudizi nei parametri valutati vascolari, un punto di orientamento è necessario. Lo IOC è una struttura ed è altamente rilevante poiché i settori di attività vascolare si trovano nella prossimità spaziale diretta. Per valutazione coerente, la scansione della retina dovrebbe essere diviso in più sezioni di immagine rettangolare con una distanza costante al cio. L’intera retina dovrebbe essere analizzata e immagini numericamente simmetricamente distribuite. La retina di zebrafish Mostra aree con densità capillare ad alta e bassa e un’iniqua distribuzione delle sezioni di immagine può portare a ulteriori pregiudizi.

Figura 12: presentazione di esempio di parametri vascolari come lettura di visualizzazione del sistema vascolare retinico. Misurazione della distanza intervascular (doppia freccia rossa) vicino l’ottica interna del cerchio (IOC) (A). Tre punti di ramificazione (cerchi rossi) vicino alla IOC (B). Visualizzazione del sistema vascolare retinico di zebrafish con un’area allargata (scatola rossa) mostrando un vaso germinazione (C). Diametro del vaso misurato oltre una certa distanza (doppia freccia bianca) dall’arteria centrale (croce bianca) (D). La densità del vaso è la percentuale di area retinica occupato sovrapponendo le navi (linee rosse diagonali) (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per misurare la distanza intervascular, bisogna impostare una certa distanza al cio come standard (Figura 12A, bianca doppia freccia) e disegnare una linea orizzontale immaginaria (Figura 12A, riga bianca orizzontale) parallelo al cio. La distanza tra i vasi su questa linea sommati e aritmeticamente una media corrisponde alla distanza intervascular. Punti di ramificazione sono contati all’interno di ogni immagine, ogni volta che una nave si divide e più lumen vascolare continuare dal punto di origine. Questo include anche collegamenti orizzontali tra i capillari. È importante rimanere coerenti con analisi e decidere quali punti di ramificazioni di contare e mantenere queste regole in tutta l’intero esperimento per ridurre le variazioni non necessari. Germogliatura vascolare, come illustrato nella Figura 12, è un altro parametro che può essere contato in ogni immagine per valutare l’influenza sul sistema vascolare retinico. Angiogenici germogli non seguono la successione di arcade come tra arteria centrale e IOC e messa a fuoco vicino le parti esterne della retina. Per valutare alcuni diametri vaso, un punto di orientamento è sempre necessaria da cui una distanza impostata segna la misurazione spot. Origine di arteria centrale all’interno della retina fornisce tali orientamenti per i vasi del fusto principale (Figura 12D, croce bianca). L’area occupata da vasi (Figura 12E, linee diagonali rosse) come percentuale dell’area intera retinica è la densità vascolare e indirettamente correla alla zona avascolare.

Una completa scansione confocale di un campione dovrebbe essere composto da più immagini ad alto dettaglio per permettere la visualizzazione di piccole hypersprouting capillare. Per ottimizzare tempo e risorse spese in questa fase, una procedura di lavorazione automatizzata deve essere utilizzata con una profondità di scansione generale per ogni piastrella. Montaggio irregolare della retina può aumentare notevolmente il tempo impiegato per eseguire la scansione del sistema vascolare con un microscopio confocale. In un approccio ottimale uno vorrebbe solo scansione strato vascolare (Figura 13B, scatola bianca), ma l’inclusione parziale del GCL è spesso necessario.Lasciando una lunghezza in eccesso del nervo ottico dopo il troncamento, come pure i tagli per ottenere il piatto-mount essendo troppo breve, può portare a montaggio irregolare.

Figura 13: confronto di lui macchiatura e autofluorescenza nella retina zebrafish adulto. Sistema vascolare retinico a fuoco sopra la GCL (A). Vasculature retinico (scatola bianca) mostrando verde un segnale EGFP e strati retinici esibendo forte autofluorescenza ((B)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Come la preparazione adeguata del vasculature retinico di zebrafish ha bisogno di una formazione preliminare, un campione di piccole dimensioni con dissettore inesperti e fortemente di variazione risultati di preparazione sono una limitazione principale della tecnica. Mentre la preparazione del tg(fli:EGFP) dello zebrafish dà veloce informazioni sullo stato del sistema vascolare, la tecnica utilizza ancora circa 20 min di tempo lavoro per retina per un ricercatore esperto. Tutti questi passaggi di preparazione per il sistema vascolare retinico devono essere eseguiti sotto un microscopio per dissezione e dissettori necessità di rimanere concentrato tutto il tempo come un passo incauto può potenzialmente indurre rottura del vaso. Il dissettore dovrebbe praticare regolarmente come assenza prolungata dalla preparazione riduce la probabilità di un dissettore di mantenimento dell’integrità del vaso.

Inoltre, ulteriore lettura tramite immunoistochimica (IHC) è ancora limitata, come solo un piccolo numero di anticorpi convalidati sul tessuto umano e del roditore stanno lavorando con il danio zebrato. Gli sperimentatori interessati in IHC si consiglia di cercare gli anticorpi specifici di zebrafish, specialmente quando si lavora con nuovi obiettivi. In alternativa, si consiglia di utilizzare linee di reporter di zebrafish aggiuntive che sono utili per studiare le cellule di là del sistema vascolare nell’occhio. Questa strategia, tuttavia, è che richiede tempo, come ci vogliono un paio di mesi per generare linee di zebrafish adulto che trasportano più giornalisti transgenici.

Tuttavia, il pesce zebra pone una serie di vantaggi. Sono relativamente piccoli e si riproducono facilmente. Possono crescere rapidamente a stadi adulti e i loro embrioni sono ottimali per lo screening di stupefacenti. Il campo è prontamente in crescita e più letteratura è sempre accessibile. Con la capacità di generare knockouts gene ad una velocità rapida e un’abbondanza di linee di transgene fluorescenza reporter, la scelta per zebrafish è trattenuta solo dalla domanda di ricerca selezionate.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrei ringraziare Katrin Bennewitz e Marlene Hausner per zebrafish zootecnica e assistenza tecnica. Gli autori riconoscono il supporto del Core Facility Live Cell Imaging Mannheim presso il centro per la biomedicina e Mannheim di tecnologia medica (DFG INST 91027/9-1). Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (International ricerca formazione gruppo 1874/1 “DIAMICOM”, progetto SP5 e SP9; Collaborative Research Centre SFB1118, progetto B1 e Collaborative Research Centre SFB/TR23 progetto Z5).

Materials

NaOH	Roth	6771.3
KCl	Merck	1.04936
CaCl_2*6H₂0	Roth	5239.2
MgSO_4*7H₂0	Merck	1.05886.0500
Paraformaldehyd	Roth	0335.3
Sodium dihydrogen phosphate	Roth	2370.1
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine)	Sigma	A5040
PBS	Roth	9143.1
Agarose	Roth	2267.3
Fluoromount-G	Thermo-Fischer	00-4958-02
Petri dish	Greiner Bio one	633180
Six-well plate	StarLab	CC7682-7506
Needle	MSG Praxisbedarf	BD 300900
Micro Tweezer	World Precision Instruments	14095
Microdissection Scissor	World Precision Instruments	501778
Glass slide	Carl Roth	H872.1
Coverslip 22mmx22mm	neoLab	103512222
Scalpel	MSG Praxisbedarf	FEA111
Epi-Illumination	Leica	10446389
Fluorescence stereomicroscope MZ10 F	Leica	NA
Confocal laser-scanning microscope SP5 DS	Leica	NA
Stereomicroscope M80	Leica	NA
Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype	NA	NA	see Reference 15
Mayer’s hematoxylin	Dr. K. Hollborn & Söhne	0088663
0.5% eosin	Dr. K. Hollborn & Söhne	NA
99,9% ethanol	Roth	9065.2
Paraffin	Merck	1,071,501,000
Xylol	Roth	4436.2
Acetone	Emsure	606-001-00-8
Microtome RM 2165	Leica	NA

Riferimenti

WHO. . Global report on diabetes. , 88 (2016).
Lim, A. Diabetic nephropathy – complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172 (2016).
Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705 (2012).
Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).
Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).
Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Wiggenhauser, L. M., Kohl, K., Dietrich, N., Hammes, H., Kroll, J. Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature. J. Vis. Exp. (130), e56674, doi:10.3791/56674 (2017).