Che istituisce un modello murino di una neuropatia pura piccola fibra con l'agonista Ultrapotent di Transient Receptor potenziali vanilloidi tipo 1
Summary
Questo studio stabilisce un modello sperimentale di neuropatia pura piccola fibra con resiniferatossina (RTX). Una dose unica di RTX (50 µ g/kg) è ottimale per lo sviluppo di un modello di neuropatia di piccole fibre che imita le caratteristiche dei pazienti e potrebbe aiutare a studiare il significato molecolare nocicettivo sottostante il dolore neuropatico.
Abstract
I pazienti con diabete mellito (DM) o quelli che avvertono gli effetti neurotossici di agenti chemioterapeutici possono sviluppare disturbi della sensazione a causa di degenerazione e lesioni dei neuroni sensoriali di piccolo diametro, indicato come neuropatia delle piccole fibre. Presenti modelli animali della neuropatia delle piccole fibre influenzano entrambi fibre sensoriali di diametro grande e piccolo e così creano un neuropathology troppo complessa per valutare adeguatamente gli effetti dell’infortunato fibre sensoriali di piccolo diametro. Pertanto, è necessario sviluppare un modello sperimentale di neuropatia pura piccola fibra di esaminare adeguatamente questi problemi. Questo protocollo descrive un modello sperimentale di neuropatia delle piccole fibre in particolare che interessa i nervi sensoriali di piccolo diametro con resiniferatossina (RTX), un ultrapotent agonista del recettore transitoria potenziali vanilloidi tipo 1 (TRPV1), attraverso una singola dose di iniezione intraperitoneale, indicato come neuropatia RTX. Questa neuropatia RTX ha mostrato manifestazioni patologiche e le anomalie del comportamento che imitano le caratteristiche cliniche dei pazienti con neuropatia delle piccole fibre, tra cui la degenerazione di intraepidermal fibre nervose (IENF), in particolare lesioni in neuroni di piccolo diametro e l’induzione di hypoalgesia termica e allodinia meccanica. Questo protocollo testato tre dosi di RTX (200, 50 e 10 µ g/kg, rispettivamente) e ha concluso che una dose critica di RTX (50 µ g/kg) è necessaria per lo sviluppo delle manifestazioni di neuropatia tipica piccola fibra e preparato una procedura di immunostaining modificate per indagare IENF degenerazione e lesioni di soma neuronale. La procedura modificata è veloce, sistematica ed economica. Valutazione comportamentale del dolore neuropatico è fondamentale per rivelare la funzione dei nervi sensitivi di piccolo diametro. La valutazione delle soglie meccaniche nei roditori sperimentali è particolarmente impegnativa e questo protocollo descrive una rete metallica su misura che è adatta per questo tipo di valutazione nei roditori. In sintesi, la neuropatia RTX è un nuovo e facilmente stabilito modello sperimentale per valutare il significato molecolare e intervento sottostante dolore neuropatico per lo sviluppo di agenti terapeutici.
Introduction
Neuropatia delle piccole fibre che coinvolge il dolore neuropatico, che è evidente dalla degenerazione di IENFs, è comune a vari tipi di condizioni, quali DM e come conseguenza degli effetti neurotossici di agenti chemioterapeutici1,2, 3,4,5. IENFs sono i terminali periferici di piccolo diametro neuroni situati nei gangli di radice dorsale (DRG) e sono interessati in parallelo nei casi di degenerazione di IENF6. Ad esempio, la trascrizione genetica a Monte alterata di somata neuronali ha dimostrata il upregulation di attivazione trascrizione factor-3 (ATF3)6,7. Inoltre, la valutazione dell’innervazione IENFs con la biopsia della pelle è utile per la diagnosi di piccole fibre neuropatia5,8,9. Tradizionalmente, i profili di IENFs sulla biopsia della pelle hanno dipendeva dimostrazione immunohistochemical del prodotto del gene della proteina di 9,5 (PGP 9.5)1,10,11. Presi insieme, i profili patologici dei DRG e IENFs riflettono la neuropatia delle piccole fibre sottostante condizione funzionale e possono essere un indicatore per le conseguenze funzionali di questo tipo di neuropatia sui neuroni di piccolo diametro.
In precedenza, diversi modelli sperimentali hanno affrontato la questione della degenerazione IENF nei casi della neuropatia indotta da chemioterapia12,13 e nervo ferita causata da compressione o transection14,15 , 16. questi modelli sperimentali anche colpiti i nervi di grande diametro; era, quindi, non è possibile escludere il contributo dei nervi interessati di grande diametro nella neuropatia osservati piccola fibra; per esempio, l’esame di thermosensation disordine da ritiro nociva dipende dalle fibre nervose motorie funzionali17,18,19. Così, che stabilisce un modello di pura fibra piccola neuropatia e indagare sistematicamente lo stato patologico di somata neuronali e loro fibre nervose periferiche cutanee nei neuroni di piccolo diametro sono necessarie e imperativo.
RTX è un analogo di capsaicina e un potente agonista al recettore transitoria potenziali vanilloidi recettore 1 (TRPV1), che media elaborazione nocicettivo20,21,22. Recentemente, periferico RTX trattamento alleviato dolore neurogeno23,24,25 e un’iniezione intragangliari di RTX indotto irreversibile perdita di neuroni DRG22. L’effetto della somministrazione periferica di RTX è dose-dipendente20,26,27, che ha provocato la desensibilizzazione transitoria o degenerazione di IENFs. Intrigante, sistematico della alto-dose RTX trattamento ha condotto a dolore neuropatico28, un sintomo della neuropatia delle piccole fibre. Questi risultati suggeriscono che la modalità di trattamento e la dose di RTX produrre effetti patologici distinti e risposte neuronali; vale a dire, somministrazione periferica impedita la trasmissione del dolore da effetti locali29 e colpite il somata neuronale che sviluppato neuropatico comportamento6. Collettivamente, questi risultati indicano che RTX ha un effetto di multipotenza e sollevato la questione se esista una dose specifica di RTX che potrebbero influenzare sistematicamente i nervi periferici, come il IENFs periferico e centrale somata neuronali. Se è così, RTX potrebbe essere un potenziale agente specificamente influenzano i neuroni di piccolo diametro e imitano neuropatia delle piccole fibre nella clinica. Ad esempio, DM nella clinica è una questione complessa compreso disordine metabolico e neuropatologia dei nervi periferici, che sono le principali caratteristiche della neuropatia delle piccole fibre. I meccanismi della neuropatia associata DM piccola fibra non ha potevano escludere il contributo del disordine metabolico che potrebbe non essere l’agente principale che interessa i nervi periferici. Di conseguenza, neuropatia associata DM piccola fibra richiede un modello animale puro che potrebbe escludere gli effetti di sistematico disordine metabolico. Questo protocollo descrive la dose di lavoro di RTX per sviluppare un modello di neuropatia tipica piccola fibra, compreso IENF degenerazione e lesioni del neurone di piccolo diametro, come dimostrato dall’analisi di immunostaining modificate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terapia efficace della neuropatia delle piccole fibre nella clinica è necessaria per promuovere il recupero funzionale e la qualità della vita dei pazienti. Attualmente, c’è mancanza di una guida terapeutica targeting sensoriale disordine connesso con neuropatia delle piccole fibre dovuta alla mancanza di comprensione dei meccanismi molecolari alla base di lesione di un neurone di piccolo diametro. Modelli precedenti di neuropatia solitamente colpiti entrambi i nervi sensoriali di grande e piccolo-diametro; per esempi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero della scienza e tecnologia (106-2320-B-037-024), Università medica di Kaohsiung (KMU-M106028, KMU-S105034) e obiettivo per il Top Università Grant (TP105PR15), Università medica di Kaohsiung, Taiwan.
Materials
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
Riferimenti
- Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
- Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
- Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
- Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
- Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
- Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
- Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
- Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
- Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
- Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
- Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
- Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
- Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
- Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
- Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
- Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
- Neubert, J. K., et al. Peripherally induced resiniferatoxin analgesia. Pain. 104 (1-2), 219-228 (2003).
- Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
- Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund’s adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
- Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), 1253-1258 (2002).
- Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
- Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
- Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
- Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
- Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
- Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
- Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
- Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
- Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
- Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
- Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
- Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
