Constitutieve en afleidbare systemen voor genetische In Vivo wijziging van muis hepatocyten gebruik hydrodynamische staart veneuze injectie
Summary
Hydrodynamische staart veneuze injectie van transposon gebaseerde integratie vectoren kan stabiele transfectie van lymfkliertest hepatocyten in vivo. Hier presenteren we een praktische protocol voor Transfectie systemen waarmee de langdurige constitutieve uitdrukking van een enkele transgenic of gecombineerde constitutieve en doxycycline-afleidbare expressie van een transgenic of miR-shRNA in de lever.
Abstract
In onderzoeksmodellen van leverkanker, regeneratie, ontsteking en fibrose zijn flexibele systemen voor in vivo genexpressie en zwijgen zeer nuttig. Hydrodynamische staart veneuze injectie van transposon gebaseerde constructies is een efficiënte methode voor genetische manipulatie van hepatocyten in volwassen muizen. Naast constitutieve transgenic expressie, kan dit systeem worden gebruikt voor meer geavanceerde toepassingen, zoals gene shRNA-gemedieerde knock-down, implicatie van het CRISPR/Cas9-systeem voor het opwekken van genmutaties, of afleidbare systemen. Hier, is de combinatie van constituerende CreER expressie samen met afleidbare uitdrukking van een transgenic of miR-shRNA van keuze gepresenteerd als een voorbeeld van deze techniek. We hebben betrekking op de procedure van de scriptingregel vanaf de voorbereiding van het Doornroosje-transposon construeert, aan de injectie en de behandeling van muizen, en de voorbereiding van leverweefsel voor analyse door immunokleuring. Het systeem gepresenteerd is een betrouwbare en efficiënte aanpak om te bereiken van complexe genetische manipulaties in hepatocyten. Het is bijzonder nuttig in combinatie met Cre/loxP gebaseerde muis stammen en kan worden toegepast op een verscheidenheid van modellen in het onderzoek van de leverziekte.
Introduction
Chronische leverziekte presenteert een belangrijke gezondheid last wereldwijd1. Dierlijk onderzoeksmodellen zijn essentiële instrumenten in de studie van de leverziekte en hebben geholpen om complexe vragen in lever regeneratie, hepatische ontsteking, en steatosis, alsmede leverkanker2te beantwoorden. Een aanzienlijk aantal van deze dierlijke modellen, is afhankelijk van de genetische modificatie van levercellen. Efficiënte tools voor het manipuleren van genexpressie in hepatocyten zijn daarom nuttig3. Gevestigde methodes zoals het kweken van genetisch gemanipuleerde muis stammen of het genereren van virale vectoren voor hepatocyte infectie zijn beide tijdrovend, haven bezorgdheid over de veiligheid, of oogst van arme transgenic expressie in hepatocyten in vivo 4 , 5. hydrodynamische staart veneuze injectie (HTVI) is een alternatieve methode voor in vivo transfectie van hepatocyten toestaan voor gemakkelijk, snel en kostenefficiënt ondervraging van de genfunctie in de lever. Voor HTVI, wordt een vector die de gewenste opeenvolging van DNA opgelost in een volume zoutoplossing overeenkomt met 10% van het lichaamsgewicht van het dier, ingespoten. De oplossing wordt vervolgens geïnjecteerd in de ader van de staart binnen 5-10 s6. Meer dan de cardiale output, mondt de zoutoplossing van de vena cava inferior uit in de lever aderen, wat leidt tot uitbreiding van de lever en hydrodynamische transfectie van hepatocyten7. Om te bereiken van stabiele genomic integratie, heeft de methode transposon gebaseerde vectoren, zoals het transposon sleeping beauty –systeem zijn samengevoegd. Deze systemen bemiddelt de recombinatie van doel vectoren met genomic recombinatie sites gekatalyseerd door een sleeping beauty –transposase8,9. Voor modellen van leverfibrose of carcinogenese is het vaak wenselijk aan overexpress of stilte genen op bepaalde tijdstippen van de ziekte-model. Voor dit doel, tools voor afleidbare genexpressie zoals het Cre/LoxP-systeem of het tetracycline-afleidbare gen expressie systeem (Tet-On) gebruikte10kan worden.
Hier beschrijven we een protocol voor in vivo transfectie van lymfkliertest hepatocyten met behulp van de HTVI van een schone slaapster transposon-gebaseerd systeem. Naast een protocol voor stabiele, constitutief uitdrukking van een transgenic onder de controle van een lever-specifieke promotor, beschrijven we een meer geavanceerde vector systeem dat constitutieve tamoxifen-afhankelijke Cre recombinase (CreER) expressie met combineert de afleidbare uitdrukking van een transgenic of microRNA-aangepast shRNA (miR-shRNA), genaamd de pTC TET-systeem11. In dit systeem vector zijn afleidbare transgenen of miR-shRNAs voor tetracycline-afhankelijke expressie gekloond in de ruggengraat vector met een recombinational klonen systeem, waardoor het snel en gemakkelijk generatie van nieuwe vectoren12. Deze gids videogebaseerd vindt de voorbereiding van geschikte vectoren, injectie en behandeling van muizen om afleidbare transgenic/miR-shRNA expressie, en ten slotte voorbereiding van leverweefsel voor analyse. De methode die wordt beschreven in dit protocol werd ontworpen om de combinatie van elk Cre/loxP gemedieerde muis systeem met de uitdrukking of knock-down van een gen van keuze, waardoor het een breed toepasbaar systeem in het onderzoek van de leverziekte.
Protocol
Representative Results
Discussion
De transfectie van hepatocyten met hydrodynamische staart veneuze injectie is een gevestigde methode geworden sinds de invoering ervan meer dan 15 jaar geleden6. Het geïnjecteerde volume overschrijdt van de cardiale output en stroomt de sinusoïdes van de lever7, leiden tot de transfectie van ongeveer 10-20%, in sommige gevallen oplopen tot 40% van hepatocyten25,26van de vena cava inferior. Voorspellers van een suc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Deutsche Krebshilfe, Duitsland (subsidie getal 111289 UE), de Lucile Packard Foundation voor de gezondheid van kinderen (Ernest en Amelia Gallo begiftigd Postdoctoral Fellowship – CTSA subsidie nummer UL1 RR025744 UE). Wij danken Dr Mark A. Kay voor vector constructies en experimentele advies en Dr. Julien Sage voor muizen en experimentele ondersteuning.
Materials
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
Riferimenti
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
- Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
- Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
- Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
- Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
- Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
- Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
- Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
- Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
- Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
- Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
- Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
- Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
- Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
- Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
- Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
- Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
- Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
- Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
- Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
- Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
- Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
- Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
- Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
- Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
- Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
- Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
- Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).
