에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법

모든 수술 및 동물 취급 절차 관리 및 실험 동물 사용 (국가 연구 위원회)의 인디애나 대학 학교의 약 기관 동물 관리 및 사용 지침에 대 한 가이드 아래 승인으로 수행한 위원회입니다. 1. 수술 준비 척추 안정제를 포함 하 여 모든 수술 도구를 소독. 수술 테이블 및 70% 에탄올과 모든 주변 지역 청소. 비 생존 수술의 준비, 37 ° C가 열 패드 상단 깨끗 한 수술 패드 장소. 6 주 오래 된 Sprague Dawley (SD) 쥐를 사용 하 여이 연구에 대 한. 무게와 케 타 민 (87.7 mg/kg) 및 xylazine (12.3 mg/kg) 혼합물의 복 주사와 쥐를 anesthetize. 동물 발가락 꼬집어 자극에 응답을 중단 하는 경우 마 취의 적절 한 단계를 확인 합니다. 피하 주사 0.01-0.05 mg/kg Buprenorphine 및 5 mg/kg Carprofen 수술 전에. 2 지역에 쥐 면: 뒷면 및 목 지역을 가슴 쪽에 자 궁 경관 등뼈 지역. 70% 알코올 잎사귀 betadine 외과 스크럽과 피부 영역 면봉. 수술 중 안구 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고를 적용 합니다. 깨끗 한 수술 패드에서 부정사 위치에 동물을 놓습니다. 2. 외부 경 정 맥 도관 법 외부 경 정 맥, 쇄 골 근처 펄스 포인트를 찾는 하 여 찾아서 3 해 부 포인트 크로스 포인트는 자리에 수직 절 개를 만들기 위해 작은 봄이 위 컷: 오른쪽 mandible의 큰 결 절의 꼬리 ramus 상 완 골 및 위 (그림 1A). 봄이 위 및 미세 집게를 사용 하 여 선박을 격리 합니다. 1 메 마른 외과 봉합 사 선 (그림 1C)20선단부를 묶어. 1 1 mL 주사기 가득 염 분 및 21-게이지 바늘 (그림 1B)에서 만든 특수 카 테 터와 연결을 준비 합니다. 그릇에 마이크로 위를 사용 하 여 작은 절 개를 하 고 선박에는 카 테 터를 슬라이드. 두 인접 하 고 원심 끝 (그림 1C)을 매 서 바늘을 보안 합니다. 특수 카 테 터는 21-게이지 바늘에서 이루어집니다. 갈기 플랫 팁 및 용접 팁의 2 밀리미터 조각으로 또 다른 21-게이지 바늘에서 잘라. 이 밖에 미 끄 러에서 테를 방지할 수 있습니다. 참고: 바늘에 흐르는 혈액의 작은 양의 바늘 혈관을 성공적으로 입력 했습니다 나타냅니다. 3. 척추 안정화 및 C5-C7 Laminectomy 경향이 위치에 동물을 놓습니다. 원하는 척추 레벨에서 15 번 메스 블레이드와 중간 선 따라 피부를 잘라. 근육 레이어 5회 에서 7번째 경관 척추 (C5-C7) 양측 측면 측면 (그림 2A)21폭로 해 부. 참고: 고 견 사이 스파이크를 찾는 하 여 두 번째 흉부 척추를 (T2)을 찾습니다. C7 척추21,22,,2324찾을 T2 척추에서 위쪽으로 계산 합니다. 수정 된 안정화 장치를 사용 하 여 쥐의 척추를 안정화 합니다. 측면 척추 뼈의 양쪽에 슬릿을 만듭니다. 스테인리스 스틸 팔 노출된 가로 프로세스 측면 아래 슬라이드와 안정성 (그림 2B)를 확보 하 고 나사를 조입니다. 조심 스럽게 제거 C5-C7 하기 (laminectomy, 그림 2C). 계속 moisturized (그림 2D) 노출된 dura mater 위에 식 염 수에 젖은 gelfoam의 작은 조각을 넣으십시오. 4. 2 광자 (2 P) 이미징 창 설치 물건 작은 조각의 gelfoam 근육과 척추 뼈 사이의 간격으로 또한 척수와 척추 뼈 사이 gelfoam의 얇은 라인을 물건 다음 조직 접착제 접착제를 사용 하 여 근육-뼈 주변을 밀봉 하기 위하여. 완전 한 건조 (그림 2E)에 대 일 분 기다립니다. 참고: 이 단계는 효과적으로 창 시키는 침수 솔루션으로 미래의 출혈을 방지 합니다. DdH2O 전자 레인지에 4 %agar 준비 합니다. 고 한 천이 녹는 완전히 후 만질 수 있는 온도에 반환 될 때까지 기다립니다. 한 솔루션으로 1 mL의 멸 균 주사기를 (그림 2E) 벽을 만들려고 윈도우의 가장자리에 파이프. 솔루션 신속 하 게 굳은 렌즈 또는 목표 자유롭게 이동할 수 있도록 유연 하 고. 이미징에 대 한 준비를 하는 경우 2 P (그림 2F) 이미징에 대 한 창 gelfoam 및 장소 침수 액체를 제거 합니다. 2 광자 현미경 어두운 챔버 내부 안정화 동물 전송 및 2 P 이미징 창 렌즈 아래에 직접 배치. 이미지 창으로 렌즈를 신중 하 게 낮은. 5. 첫 번째 형광 염료 및 초기 이미징의 주입 0.5 mL Rhodamine B isothiocyanate-Dextran의 준비 (4 mg/mL 평균 분자량 ~ 70kDa) 염 분에. 솔루션 1 mL의 멸 균 주사기를 이전에 설치한 카 테 터에 주사기를 연결. 참고: 형광 염료 솔루션을 준비 하 고 전에 사용 하는 것이 좋습니다. 주사기를 매우 느리게 우울 하 여 첫 번째 염료를 주사 (그림 3B). 먼저, 관심의 영역을 식별 하는 접 안 렌즈를 사용 합니다. 충전 결합된 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여 랜드마크 이미지와 낮은 확대율에서 표면 혈관 패턴의 밝은 필드 이미지를 얻으려고. 전환 하 레이저 스캐닝 모드와 다음 두 이미지를 수집 하기 위한 소프트웨어 이미징 2p를 열고 고 라인 스캔 데이터. Fluorophores 군데 조직에 있는 사용에 맞게 적절 한 2 P 레이저 여기 파장, 전력 및 형광 채널 (첫 번째 염료 빨강 채널)을 선택 하 고 vivo에서 화상 진 찰 (그림 3E)를 수행. 전체 과정에서 열 패드에 동물 유지. 6. C7 Contusive 부상 리사 장치를 사용 하 여 C7 중간 타 박상 부상 이전 설립된 프로토콜25,26에 따르면 루이빌 부상 시스템 장치 (리사) 장치를 사용 하 여 수행 합니다. 간단히, 다음 보정 리사 무대에 동물을 배치 합니다.0 포인트 설정을 선택 하 고 조직 조정 후 변위 (이 경우 0.800 m m), 소프트웨어 충돌 릴리스를 실행 하 고 부상을 만들의 “실험 실행” 버튼을 클릭 합니다. 부상, 후 식 염 수에 젖은 gelfoam moisturized 유지 하 노출된 dura mater 위에 다른 작은 조각을 놓습니다. 4.3 단계를 반복 하 고 다시 수행 vivo에서 화상 진 찰 이전 주입된 붉은 염료와 표시 같은 지역에 (그림 3C & F). 동물 다시 수술 테이블에 전송 하 고 동물 IACUC IUSM 프로토콜에 따라 적절 한 마 취와 진정을 유지. 7. 두 번째 형광 염료 주입 후 부상 영상 염 분에 Fluorescein isothiocyanate-dextran (4 mg/mL, 평균 분자량 ~ 70 kDa) 0.5 mL를 준비 5.1에서 동일한. 1 mL의 멸 균 주사기에서 솔루션을 작성 하 고 이전에 설치 된 카 테 터와 연결. 2 P 현미경 어두운 챔버 내부 안정화 동물 다시 전송 하 고 다시 첫 번째 염료에 대 한 빨강 채널와 두 번째 염료에 대 한 녹색 채널 같은 지역 이미지 (3D 인물 & G). 영상의 마지막에 척추 안정화 장치에서 쥐 놓고 천 벽 청소. 8. 동물 희생 이미징, 후 transcardial 관류 프로토콜27다음 쥐를 희생. 척수 샘플을 수집 하 고 4%에 그들을 수정 PFA. 9. 오프 라인 데이터 분석: 혈관 직경의 정량화 오프 라인 분석에 대 한 워크스테이션에 이미지 파일을 전송. ImageJ 고 “파일”을 선택 하 고 이전 저장 된 원시 데이터 선택 열고 연관 된 단일 이미지 파일 (그림 4B). “분석” “비율 설정” (그림 4C) 다음을 선택 하 여 이미지를 보정. “픽셀에서 거리”에 배치 하는 값은 그림 4A에 표시 하는 수식을 사용 하 여 계산 됩니다. 2 광자 광 렌즈의 교정 방정식에 기본 값을 결정합니다. “OpticalZoom”의 값은 Excel 확장 태그 Languagefile (XML 파일) 단일 이미지 파일 (그림 4B)와 관련 된에서 발견 된다. 혈관의 긴 축에 수직인 선 그리기 (그림 4D1 & E1)와 “분석” 뒤에 “측정”을 선택 하십시오. 혈관 직경의 측정 결과 창에 표시 됩니다 (그림 4D2 & E2). 평균 값을 얻으려고 선박에서 3 회를 반복 한다. 10. 오프 라인 데이터 분석: 빨간 혈액의 정량화 셀 (RBC) 속도 분석을 위한 워크스테이션을 라인 스캔 파일을 전송. ImageJ 소프트웨어 시작 고 “파일”을 선택 하 고 이전 저장 된 원시 데이터 선택한 확장 이름 “.ome”와 모든 연결 된 라인-스캔 파일을 열. “이미지”를 열고 “스택” 뒤에 “스택 이미지”를 선택 합니다. 단일 이미지 스택 TIFF 파일로 모든 오메 파일을 변환 합니다. Matlab 소프트웨어를 시작 하 고 “열기”를 클릭 합니다, 그리고 “LSPIV_parallel.m” 코드 파일을 선택 합니다. 참고: LS-PIV를 위한 Matlab 코드 https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18 에서 다운로드 될 수 있다 다음 주문을 선택: “실행” > “폴더 변경” > “동맥”. 10.3에서 생성 된 이미지 스택 TIFF 파일을 선택 합니다. “Y”를 입력 하 고 Enter 키를 누릅니다. 커서를 왼쪽 및 오른쪽 이미지의 각각, 그리고 프로그램 데이터 처리 하기 시작. 프로그램의 끝에, 최종 읽기 계산을 2 값을 입력: “pixel_meter 변환 값”, 그리고 “스캔 시간 변환 값”. 둘 다 라인 스캔 데이터와 관련 된 XML 파일에서 찾을 수 있습니다. 최종 값으로 평균 및 표준 편차 (mm/s) 당 밀리미터의 단위로 속도의 표시 됩니다.